DNS法,全称为3,5-二硝基水杨酸比色法，是生物化学、食品科学及微生物学领域中一种经典且应用广泛的分析技术，其核心功能是定量测定样品中的还原糖含量，并通过水解步骤，实现对总多糖的间接检测，该方法因其操作简便、成本低廉、灵敏度高且适用于大批量样品分析而备受青睐。
核心检测原理
DNS法的化学基础是氧化还原反应,在碱性条件下，DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）本身呈黄色，当它与具有游离醛基或酮基的还原糖（如葡萄糖、果糖）共热时，还原糖的醛基会被DNS氧化成羧基，而DNS则被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，这个有色物质的生成量与还原糖的浓度在一定范围内成正比关系，通过使用分光光度计在特定波长（通常为540 nm）处测量反应液的吸光度，即可准确定量还原糖的含量。
多糖检测的关键步骤
由于大多数多糖（如淀粉、纤维素）本身不具备还原性，无法直接与DNS试剂发生显色反应，因此检测多糖需要增加一个关键的水解步骤。
- 样品水解：精确称取待测多糖样品，加入一定浓度的强酸（如盐酸或硫酸），在沸水浴中加热一段时间，此过程旨在将多糖大分子链断裂，水解成其组成的单糖（如葡萄糖），这些单糖均为还原糖。
- 中和与定容：水解完成后，需要用碱（如氢氧化钠）中和多余的酸，并将溶液转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到含还原糖的待测液。
- DNS显色反应：取一定量的待测液，加入DNS试剂，再次置于沸水浴中精确加热数分钟（通常为5-15分钟），以充分完成显色反应。
- 冷却与比色：反应结束后，将试管迅速冷却至室温，以终止反应并稳定颜色，随后，将反应液适当稀释（如果颜色过深），在540 nm波长下测定其吸光度值。
- 结果计算：需要用一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，按同样步骤处理并绘制“吸光度-浓度”标准曲线，将样品测得的吸光度值代入标准曲线方程，计算出待测液中还原糖的浓度，结合样品称重量、稀释倍数和水解过程中的化学计量关系，反算出原始样品中多糖的百分含量。
DNS法的优缺点
为了更直观地评估该方法,下表小编总结了其主要优缺点：
| 优点 | 缺点 |
|---|---|
| 操作简便，对实验设备要求低 | 特异性不强，对所有还原糖均有响应，无法区分糖的种类 |
| 成本低廉，试剂易于配制和保存 | 强酸、强碱和高温操作，存在一定的安全风险 |
| 灵敏度高，检测范围广 | 易受样品中其他还原性物质（如维生素C、酚类）的干扰 |
| 适用于大批量样品的快速筛选和定量分析 | 水解条件（酸浓度、温度、时间）对结果影响显著，需严格控制 |
应用领域
DNS法在多个领域都发挥着重要作用,在食品工业中，它被用于测定淀粉、果胶、膳食纤维等多糖的含量；在发酵工程中，用于监测发酵过程中碳源的消耗；在生物能源研究中，用于评估纤维素原料水解成可发酵糖的效率。
相关问答FAQs
Q1：为什么DNS法不能直接检测多糖，必须先进行水解？
A1： 这是因为DNS法的检测对象是具有还原性的糖，还原糖分子结构中必须含有游离的醛基（-CHO）或酮基（-C=O），这些基团在碱性加热条件下能将黄色的DNS试剂还原成棕红色的氨基硝基水杨酸，大多数多糖（如淀粉、菊粉）是由成千上万个单糖通过糖苷键连接而成的大分子，其末端还原基团的数量相对于整个分子来说可以忽略不计，因此宏观上表现出非还原性，只有通过强酸或酶催化水解，将多糖链断裂成单个的单糖（如葡萄糖），释放出大量的还原性基团后，才能被DNS法有效检测。
Q2：在进行DNS法检测时，哪些因素最容易影响结果的准确性？
A2： 影响DNS法准确性的关键因素主要有三点，首先是水解条件，包括酸的浓度、水解温度和时间，水解不充分会导致测得值偏低，而过度水解则可能使部分单糖进一步分解，同样造成结果偏差，其次是显色反应的条件，沸水浴的温度和加热时间必须严格控制，并与制作标准曲线时的条件保持一致，否则颜色的生成量会不稳定，最后是干扰物质的存在，样品中若含有其他具有还原性的物质（如抗坏血酸、酚类化合物、某些氨基酸等），它们也会与DNS反应，导致测得的还原糖含量虚高，造成对多糖含量的错误估算，对于复杂样品，适当的预处理以去除干扰物是保证准确性的必要步骤。