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《DNS法测酶活空白实验详细指南》

在酶活性测定过程中，准确设置空白对照至关重要，采用DNS（3,5 二硝基水杨酸）法测定还原糖含量以间接反映酶活性时，空白实验能有效消除非酶促反应等因素带来的干扰，确保实验结果的准确性和可靠性，本文将详细介绍DNS法测酶活空白的相关操作步骤、原理及注意事项等内容。

实验原理

DNS试剂可与还原糖在加热条件下发生显色反应，生成棕红色的氨基化合物，其颜色深浅在一定范围内与还原糖浓度成正比，而在空白实验中，不存在由目标酶催化产生的还原糖，但可能存在其他物质（如底物自身分解产物等）也可能轻微影响吸光度读数，通过设立空白组，可以在后续计算中扣除这些背景干扰因素,从而精准地反映出真正由酶催化作用所产生的还原糖量对应的酶活性。

实验材料与仪器

实验步骤

（一）准备阶段

1. 配制DNS工作液：按照标准配方准确称取适量的DNS固体粉末，溶解于一定体积的蒸馏水中，充分搅拌至完全溶解后定容至所需浓度，通常配制后的DNS工作液应呈淡黄色透明状,若出现浑浊则需重新过滤后再使用。
2. 预热仪器：打开恒温水浴锅，设置为目标酶的最适反应温度（ 淀粉酶常为60℃），待水温稳定达到设定值后开始后续操作；同时开启分光光度计电源，预热仪器并选择合适的测量波长（一般为540nm）,进行空白调零校准。

（二）加样操作

取一支洁净干燥的具塞试管标记为“空白管”，依次加入以下成分： |成分|体积（单位：mL）|说明| |||| |缓冲液|X|与样品管中加入量相同，用于维持体系离子强度和pH环境一致| |底物溶液（不含酶）|Y|仅包含底物物质，不添加待测酶液，模拟除酶以外的其他反应条件| |蒸馏水|Z|补充总体积至与其他样品管相同,确保各管反应体系的一致性|

轻轻混匀上述溶液,避免产生气泡影响后续吸光度测定。

（三）反应过程

将装有混合液的“空白管”迅速放入已预热好的恒温水浴锅中，准确计时孵育一定时间（该时间应与正式测定酶活时的保温时间相同），在此期间，密切关注水浴锅内水位变化,防止因蒸发导致试管内液体减少过多而影响实验结果。

（四）显色与测定

孵育结束后，立即取出“空白管”，向其中加入预先准备好的DNS工作液适量（具体体积参照标准操作规程），再次混匀后迅速放回沸水浴中煮沸一定时间（如5分钟），使还原糖充分显色，取出冷却至室温后，使用分光光度计在选定波长下测定其吸光度值，记录数据,此吸光度值即为空白对照值。

数据处理与分析

在正式测定酶活时，所得各管吸光度减去空白管吸光度后得到的差值才是真正由酶催化产生的还原糖所对应的吸光度变化量，根据标准曲线方程（通过预先用已知浓度梯度的还原糖标准品绘制），可将该差值换算成相应的还原糖浓度，进而计算出酶活性单位（U/mL或U/mg蛋白等）。

注意事项

1. 严格控制反应条件：包括温度、pH、反应时间和试剂用量等均需保持一致，因为这些因素都会显著影响实验结果的准确性，尤其是温度波动可能导致酶变性失活或者反应速率改变,从而引入较大误差。
2. 避免交叉污染：在整个实验流程中，务必使用专用的移液器枪头和器具分别处理不同溶液，防止样品间的交叉污染,每次用完移液器后应及时清洗并擦干外壁残留液体。
3. 及时准确操作：从加样到显色再到测定的每一个环节都应尽快完成，减少中间等待时间过长引起的额外误差，特别是在加入DNS试剂后的煮沸显色步骤，要保证所有试管都在规定时间内完成操作,以确保显色程度一致。

相关问题与解答

问题1：为什么在DNS法测酶活时要设置空白对照？

答：因为在实验体系中，除了目标酶催化底物生成还原糖外，还可能存在其他因素导致少量的还原糖产生或者影响吸光度读数，比如底物自身的缓慢分解、杂质的存在等，设置空白对照可以扣除这些非特异性因素引起的背景干扰，使得最终计算出的酶活性更加准确可靠,只反映出真正由酶催化作用所产生的还原糖量对应的酶活性。

问题2：如果空白管的吸光度异常高是怎么回事？如何处理？

答：空白管吸光度异常高可能是由于多种原因造成的，一是底物溶液本身含有较多杂质或还原性物质，此时应重新制备纯净的底物溶液；二是DNS试剂变质失效，需要更换新的合格DNS工作液；三是操作过程中引入了外来污染物，例如移液器未清洗干净、试管内有残留异物等，这种情况下应对使用的仪器设备进行全面清洁后再重复实验，针对具体情况排查并解决问题后，再次进行空白测定直至获得合理的空白值为止