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DNS法测定还原糖数据详解 3,5 二硝基水杨酸（DNS）法是定量测定还原糖的经典方法之一，具有操作简便、灵敏度高、稳定性好等优点，广泛应用于食品工业、生物化学研究和微生物发酵等领域，本文将详细介绍DNS法测定还原糖的原理、试剂配制、实验步骤、数据处理及注意事项等内容,并通过具体的实验数据展示该方法的实际应用效果。

实验原理

DNS试剂与还原糖在碱性条件下共热后，会被还原成棕红色的氨基化合物，在一定波长范围内（通常为520nm左右），该产物的吸光度与还原糖的含量成正比，通过绘制标准曲线,可根据样品溶液的吸光度计算出其中还原糖的浓度。

试剂配制

（一）DNS试剂配制

准确称取10g 3,5 二硝基水杨酸溶于适量蒸馏水中，加入16g氢氧化钠、20mL苯酚、5g亚硫酸钠和200g酒石酸钾钠，充分搅拌溶解后，用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用,注意配制过程中要避免DNS接触空气过久而被氧化失效。

（二）葡萄糖标准溶液配制

精确称取干燥恒重的无水葡萄糖100mg，用少量蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，混匀得到浓度为1mg/mL的葡萄糖标准储备液，使用时可根据需要进行进一步稀释，如取10mL储备液稀释至100mL，得到0.1mg/mL的标准工作液。

实验步骤

1. 制作标准曲线
   • 取6支洗净烘干的具塞刻度试管，分别按表1加入不同体积的葡萄糖标准工作液（0.1mg/mL）、蒸馏水和DNS试剂。 |序号|葡萄糖标准液体积（mL）|蒸馏水体积（mL）|DNS试剂体积（mL）| ||||| |0|0|2.0|1.5| |1|0.2|1.8|1.5| |2|0.4|1.6|1.5| |3|0.6|1.4|1.5| |4|0.8|1.2|1.5| |5|1.0|1.0|1.5|
   • 将各试管充分摇匀后，置于沸水浴中加热5分钟，取出立即冷水冷却至室温，用分光光度计在520nm波长处测定各管溶液的吸光度，以零号管调零，记录数据并以吸光度为纵坐标、葡萄糖含量（μg）为横坐标绘制标准曲线。
2. 样品测定

   准确吸取一定体积经过适当稀释的待测样品溶液于试管中，按照上述标准曲线制作的步骤加入蒸馏水和DNS试剂，同样进行沸水浴加热、冷却等操作后测定其吸光度，根据样品溶液的吸光度从标准曲线上查得对应的还原糖含量,再换算出原始样品中还原糖的浓度。

数据处理示例

假设通过实验得到以下数据（仅作示例）： |序号|葡萄糖添加量（μg）|吸光度（A）| |||| |0|0|0.000| |1|20|0.156| |2|40|0.312| |3|60|0.468| |4|80|0.624| |5|100|0.780| 根据这些数据绘制的标准曲线方程为y = 0.0078x + 0.002（R² = 0.999），其中y表示吸光度，x表示葡萄糖含量（μg），若某样品测得吸光度为0.5，则代入方程可得x = (0.5 0.002)/0.0078 ≈ 63.85μg，已知样品稀释倍数为n，取样体积为V mL，则原始样品中还原糖浓度C = (63.85×n)/V mg/mL。

注意事项

1. DNS试剂应避光保存，使用前若发现有沉淀产生,需重新过滤后再使用。
2. 加热时间和温度要严格控制，否则会影响显色效果和测定结果的准确性,一般采用沸水浴加热5分钟较为适宜。
3. 比色皿在使用前要用乙醇清洗干净,避免残留杂质干扰吸光度的测定。
4. 样品溶液若有颜色或浑浊，可能会影响吸光度的测量,此时可考虑采用活性炭脱色或其他预处理方法去除干扰物质。

相关问题与解答

问题1：为什么DNS法测定还原糖时要在碱性条件下进行？

解答：在碱性环境中，还原糖能够将DNS试剂中的硝基还原为氨基，从而生成具有特定颜色的化合物，这种化学反应需要在强碱催化下才能高效地进行，因此实验体系中必须加入过量的氢氧化钠来营造碱性氛围,以确保反应顺利进行并产生足够的显色物质用于比色定量分析。

问题2：如何提高DNS法测定还原糖的准确性？

解答：可以从以下几个方面入手提高准确性：①精确配制试剂和标准溶液，使用高精度的分析天平和容量瓶；②严格控制加热时间和温度，保证每批样品的处理条件一致；③确保比色皿清洁无划痕，减少杂散光的影响；④对样品进行适当的预处理，如离心去除悬浮物、过滤除去大颗粒杂质等；⑤多做平行实验取平均值，减小随机误差；⑥定期校准分光光度计，保证仪器读数