DNS法总糖含量测定详解 DNS（3,5 二硝基水杨酸）法是一种广泛应用于定量检测还原糖的经典化学方法，具有操作简便、灵敏度高、稳定性好等优点，该方法基于还原糖在碱性条件下与DNS试剂反应生成棕红色的氨基化合物这一原理，通过比色法定量分析样品中的总糖含量，本文将详细介绍DNS法的原理、实验步骤、注意事项、数据处理及常见问题解答等内容，为相关研究人员和技术人员提供全面的指导。
实验原理
（一）反应机理
DNS试剂中的3,5 二硝基水杨酸作为一种强氧化剂，在碱性环境中能够被还原糖还原，当存在还原糖时，其醛基或酮基会将DNS中的硝基逐步还原为氨基，同时自身被氧化成相应的羧酸，这个过程中会形成一种稳定的棕红色物质——3 氨基 5 硝基水杨酸，该物质在特定波长下有显著吸收峰，且吸光度与还原糖浓度成正比，由于多糖可经水解转化为单糖（即还原糖），因此通过测定水解后的总还原糖量即可间接反映样品中的总糖含量。
（二）适用范围
本方法适用于各类食品、生物样品及化工产品中总糖含量的测定，包括但不限于葡萄糖、果糖、麦芽糖等常见单糖以及蔗糖、淀粉等寡糖和多糖的水解产物，但需注意的是，非还原性物质不会干扰此反应，保证了较高的特异性。
仪器设备与试剂材料
| 序号 | 名称 | 规格/型号 | 用途说明 |
|---|---|---|---|
| 1 | 分光光度计 | UV 可见光型 | 用于测量显色溶液的吸光度值 |
| 2 | 恒温水浴锅 | 控制加热温度以确保反应充分进行 | |
| 3 | 具塞刻度试管 | 作为反应容器并便于精确移取液体 | |
| 4 | 移液枪及配套吸头 | 准确量取不同体积的标准溶液、待测样品和试剂 | |
| 5 | 电子天平 | 称量固体试剂以配制所需浓度的标准储备液 | |
| 6 | 容量瓶（多种规格） | 稀释标准品或制备工作曲线用的系列梯度溶液 | |
| 7 | DNS试剂 | 自配：称取一定量的DNS溶于适量水中，加入氢氧化钠调节pH至适宜范围，定容保存备用 | |
| 8 | 标准葡萄糖溶液 | 预先配置好的已知浓度的标准溶液，用于建立标准曲线 |
实验步骤
（一）标准曲线绘制
- 配置系列梯度标准溶液：使用电子天平准确称取适量无水葡萄糖，用蒸馏水溶解并转移至容量瓶中，依次稀释得到一系列不同浓度的标准工作液（如0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。
- 加样与反应启动：分别吸取上述各浓度的标准溶液各1 mL加入到编号后的具塞刻度试管中，再向每管加入新配制的DNS试剂3 mL，摇匀混合均匀，然后将所有试管置于沸水浴中加热煮沸5分钟，使反应完全进行，取出后迅速冷却至室温。
- 测定吸光度：以空白管（只加了DNS试剂而未加标准溶液的那个试管）作参比调零，利用分光光度计在λ=540 nm处测定各管内溶液的吸光度值，记录数据以便后续绘图。
- 拟合标准曲线方程：以吸光度值为纵坐标(Y)，对应的标准葡萄糖溶液浓度为横坐标(X)，绘制散点图并通过线性回归分析得到一条直线方程Y = aX + b，其中a为斜率，b为截距，该方程即为本次实验的标准曲线方程，可用于未知样品浓度的计算。
（二）样品前处理与测定
- 样品预处理：对于固体样品，先粉碎过筛；液体样品可直接取样，若样品中含有大分子聚合物或其他杂质影响测定结果时，需要进行适当的提取净化操作，采用离心过滤去除悬浮颗粒物，或者用有机溶剂萃取除去脂溶性成分等。
- 适当稀释与定容：根据预估的总糖含量水平，对处理好的样品进行必要的稀释，使其最终落在标准曲线的有效范围内，通常建议稀释倍数使得预期吸光度位于0.2~0.8之间较为理想。
- 显色反应与比色测定：按照与标准曲线相同的操作流程对待测样品进行处理，即取适量稀释后的样品代替标准溶液进行加样、加DNS试剂、沸水浴加热、冷却等步骤，最后同样在540 nm波长下测定其吸光度值。
- 计算总糖含量：将测得的样品吸光度代入之前得到的的标准曲线方程中，计算出相应的葡萄糖当量浓度，再乘以样品的稀释因子即可得到原始样品中的总糖含量（以mg/g或μg/mL等形式表示）。
注意事项
- 严格控制反应条件：特别是加热时间和温度，因为它们直接影响到显色效果和吸光度的重现性，务必保证每次实验都在相同的条件下进行。
- 避免气泡产生：在混合DNS试剂和样品时要缓慢小心，防止产生过多气泡导致读数误差增大，如有气泡出现，可用细针轻轻刺破消除。
- 及时清洗比色皿：每次测量前后都要彻底清洗比色皿，并用干净的擦镜纸擦干内外壁，以免残留物影响下次测量的准确性。
- 注意安全防护：DNS试剂具有一定的腐蚀性和毒性，操作时应佩戴手套、护目镜等个人防护装备，并在通风良好的环境下进行实验。
数据处理示例
假设某次实验中获得如下一组数据： |编号|标准溶液浓度(mg/mL)|实测吸光度|理论吸光度(根据标曲计算)|相对偏差(%)| |||||| |1 |0 |0 |0 |— | |2 |0.2 |0.198 |0.201 |+1.5 | |3 |0.4 |0.395 |0.399 |+1.0 | |4 |0.6 |0.592 |0.597 |+0.8 | |5 |0.8 |0.788 |0.795 |+0.9 | |6 |1.0 |0.987 |0.993 |+0.6 |
由上述数据可以看出,实际测量值与理论值非常接近，说明此次实验的操作较为准确可靠，可以根据这些点绘制出一条近乎完美的直线作为标准曲线，进而用于未知样品的分析测定。
相关问题与解答
为什么选择540nm作为测定波长？
答：因为在该波长下，由DNS法产生的棕红色产物具有最大的摩尔吸光系数，这意味着在此波长下的吸光度最强，从而提高了检测的灵敏度和准确性，大多数分光光度计在这个波段内的性能也较为稳定可靠。
如何判断是否需要对样品进行预水解处理？
答：如果样品中含有较多的非还原性多糖（如淀粉），则需要先进行酸催化水解将其转化为还原糖形式才能应用DNS法进行测定，可以通过查阅文献资料了解目标样品的主要化学成分组成来决定是否有必要采取这一额外步骤，直接使用DNS法只能检测样品中的还原糖部分，而对于结合态存在的多