5154

DNS法测定多糖原理详解 DNS（3,5 二硝基水杨酸）法是一种常用于测定还原糖含量的方法，也可间接用于多糖的定量分析，该方法基于还原糖在碱性条件下与DNS试剂发生氧化还原反应生成有色物质的原理，通过比色法定量检测样品中多糖经水解产生的还原糖量，从而推算出多糖的含量，以下将从多个方面详细介绍DNS法测定多糖的原理、操作步骤、影响因素及注意事项等内容。

DNS法基本原理

（一）化学反应基础

DNS试剂主要成分为3,5 二硝基水杨酸，它在强碱性溶液中呈黄色，当存在还原糖时，在加热条件下，还原糖将DNS中的硝基还原为氨基化合物，自身被氧化成相应的羧酸或其他产物，同时使溶液颜色由黄色变为棕红色，这种颜色变化与还原糖的浓度在一定范围内呈线性关系，遵循朗伯 比尔定律，即吸光度与浓度成正比,这是进行定量分析的基础。

（二）多糖与还原糖的关系

多糖是由多个单糖分子通过糖苷键连接而成的高分子化合物，本身不具有还原性，但在酸性条件下加热水解后，可断裂糖苷键释放出具有游离醛基或酮基的单糖（即还原糖），淀粉水解可生成葡萄糖，纤维素部分水解也能产生葡萄糖等还原糖，通过测定水解后的还原糖含量,可以反推出原始样品中多糖的含量。

实验操作流程

（一）标准曲线绘制

1. 配制系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液：精确称取适量干燥至恒重的无水葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容到一系列不同体积的容量瓶中，得到浓度依次递增的标准溶液，一般设置5 7个浓度点,涵盖预期样品可能的浓度范围。
2. 加入DNS试剂并反应：取一定量的各标准溶液于具塞试管中，加入相同体积的DNS试剂和氢氧化钠溶液，摇匀后置于沸水浴中加热一定时间（通常为5分钟），使反应充分进行,取出冷却至室温。
3. 测定吸光度：使用分光光度计在特定波长（一般为540nm左右）下测定各管溶液的吸光度值,以蒸馏水作空白对照调零。
4. 建立标准曲线：以葡萄糖浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算出回归方程及相关系数R²，要求R²应接近1,以保证后续定量的准确性。

（二）样品测定

1. 样品预处理：准确称取一定量的待测多糖样品，加入适量稀硫酸溶液，在适宜温度下回流一段时间进行水解，水解完成后，用氢氧化钡或碳酸钙等中和多余的酸至中性，过滤去除沉淀,得到澄清滤液作为待测液。
2. 显色反应：吸取适量待测液于试管中，按照与标准曲线相同的条件加入DNS试剂和氢氧化钠溶液，混匀后沸水浴加热、冷却。
3. 吸光度测量与计算：测定样品管溶液的吸光度，代入标准曲线的回归方程中计算出样品中还原糖的浓度，再根据稀释倍数、取样量以及多糖与单糖的换算因子等因素,计算出原样品中多糖的含量。

影响结果的因素

注意事项

1. 试剂新鲜度：DNS试剂应现配现用，久置后易失效，因其性质不稳定，长时间放置会分解变质,影响显色效果。
2. 比色皿匹配性：所有用于测量吸光度的比色皿必须是同一规格且洁净无划痕,否则会导致散射光差异引入误差。
3. 平行实验：每个样品至少做三个平行样，取平均值以减少偶然误差,提高数据的可靠性。
4. 空白对照重要性：每次实验都必须设置空白对照，以扣除背景干扰，包括溶剂、试剂本身的吸光贡献等。

相关问题与解答

问题1：为什么不能用DNS法直接测定未水解的多糖？

答：因为多糖分子量大且没有游离的醛基或酮基，无法直接参与DNS试剂的氧化还原反应，只有将多糖水解成具有还原性的单糖后，才能与DNS试剂反应产生颜色变化,进而进行定量测定。

问题2：如何提高DNS法测定多糖结果的准确性？

答：可以从以下几个方面入手：①优化水解条件，确保多糖完全水解为还原糖；②严格控制反应体系的pH、温度和时间，保证反应充分且稳定；③做好样品前处理，去除杂质干扰；④精心绘制标准曲线，定期校准仪器；⑤增加平行实验次数，减小随机误差，通过这些措施的综合运用，能够有效提高测定结果的准确性