S法可测果胶酶活，其基于还原糖与试剂反应显色，通过比
DNS测果胶酶活的详细方法及注意事项
原理
果胶酶能催化果胶分解生成半乳糖醛酸等还原糖，3,5 二硝基水杨酸（DNS）与还原糖在沸水浴条件下共热，产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量与反应液颜色的深浅成正比，通过在特定波长（通常为540nm）下测定吸光度，可计算出半乳糖醛酸的含量,进而确定果胶酶的酶活力。
试剂准备
（一）DNS溶液
- 成分：酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3,5 二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21g，苯酚5g，搅拌至全溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中,室温保存。
- 作用：与还原糖反应产生颜色变化,用于定量测定还原糖含量。
（二）D 半乳糖醛酸溶液（1mg/mL）
- 配制方法：准确称取0.100g半乳糖醛酸,用蒸馏水溶解并定容至100mL。
- 用途：作为标准品，用于制作标准曲线,以便后续计算样品中的半乳糖醛酸含量。
（三）果胶底物溶液
- 配制依据：根据实验需求和待测果胶酶的特性，选择合适的果胶浓度，一般用缓冲液配制成一定浓度的果胶溶液，可用0.05M柠檬酸 磷酸氢二钠缓冲液（pH值根据具体酶的适宜pH调整）配制成1% 2%的果胶底物溶液。
- 重要性：为果胶酶提供反应底物,其浓度和性质会影响酶促反应的速率和程度。
（四）其他试剂
- 缓冲液：用于调节反应体系的pH值，确保果胶酶在最适pH环境下发挥作用，常用的有柠檬酸 磷酸氢二钠缓冲液、醋酸 醋酸钠缓冲液等,需根据实验要求配制不同pH值的缓冲液。
- 终止反应液：一般使用DNS溶液作为终止反应液,同时起到显色作用。
操作步骤
（一）标准曲线的制作
- 取试管：取7支干净试管，分别编号为0 6。
- 加试剂：按表1所示，向各试管中准确加入不同体积的D 半乳糖醛酸溶液（1mg/mL）和蒸馏水，使各试管中半乳糖醛酸的浓度梯度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL，然后向每支试管中加入1.5mL DNS溶液,混匀。
- 沸水浴：将各试管同时放入沸水浴中，加热5分钟，取出后立即用冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25mL,摇匀。
- 测吸光度：以0号试管为空白对照，在540nm波长下,用分光光度计分别测定各试管溶液的吸光度。
- 绘制标准曲线：以半乳糖醛酸浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
| 试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| D 半乳糖醛酸溶液（mL） | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 0 | 2 |
| 蒸馏水（mL） | 2 | 0 | 8 | 6 | 4 | 2 | 0 |
| DNS溶液（mL） | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
（二）果胶酶活力测定
- 预处理：将待测果胶酶溶液用相应的缓冲液稀释至适当浓度，使其吸光度在标准曲线线性范围内,将果胶底物溶液和缓冲液预热至果胶酶的最适温度。
- 反应体系：取适量稀释后的果胶酶溶液（如0.5mL）与预热的果胶底物溶液（如1.5mL）混合，迅速摇匀，立即放入恒温水浴锅中,开始计时反应。
- 取样：在反应一段时间后（如5分钟），取出一定量（如0.5mL）的反应液，立即加入1.5mL DNS溶液，以终止反应并进行显色反应，取相同体积的失活果胶酶溶液与果胶底物溶液混合,作为对照。
- 沸水浴：将上述取样后的试管放入沸水浴中，加热5分钟，取出后用冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25mL,摇匀。
- 测吸光度：以对照管为空白，在540nm波长下,用分光光度计测定样品管的吸光度。
结果计算
- 根据标准曲线求半乳糖醛酸含量：通过样品管的吸光度，在标准曲线上查出对应的半乳糖醛酸浓度（C，mg/mL）。
- 计算酶活力：酶活力（U/mL）= [（C×N×V）/（t×Vs）]×1000，C为从标准曲线查得的半乳糖醛酸浓度（mg/mL）；N为稀释倍数；V为反应体系总体积（mL）；t为反应时间（分钟）；Vs为取样体积（mL）。
注意事项
- 试剂准确性：DNS溶液应现用现配，或严格按照保存条件保存，以免影响显色效果，各种试剂的配制应准确,尤其是标准品的浓度要保证精确。
- 反应条件控制：温度、pH值等反应条件对果胶酶活力测定影响较大，应严格控制在最适条件下进行反应，反应时间要准确记录,以确保酶活力计算的准确性。
- 样品处理：待测果胶酶样品应尽量保持纯净，避免含有杂质干扰测定，如果样品中蛋白质含量较高，可能需要进行适当的预处理，如透析或离心,以去除蛋白质对测定的影响。
- 比色操作：在使用分光光度计比色时，应确保比色皿的清洁和透光性良好，每次测定前，要用蒸馏水洗净比色皿，并用擦镜纸擦干,要注意比色时的波长准确性和吸光度的读数稳定性。
相关问题与解答
（一）问题
- 为什么选择540nm波长进行吸光度测定？
- 解答：在DNS与还原糖反应生成的棕红色化合物中，在540nm波长下具有最大吸收峰，此波长下测定吸光度能够最准确地反映还原糖的含量,从而保证测定结果的可靠性和准确性。
- 如果样品颜色过深，对比色测定有干扰怎么办？
- 解答：可以采取适当稀释样品的方法来降低颜色深度，但要注意稀释倍数的准确性，并在计算结果时考虑稀释因素，也可以尝试通过离心、过滤等方法去除样品中的不溶性杂质，以减少颜色干扰，但如果杂质与测定物质结合紧密,可能需要采用更复杂的分离技术或更换测定方法。
DNS法测定果胶酶活是一种有效且实用的方法，通过精心准备试剂、严格控制操作步骤和注意各项细节，