总糖还原糖测定DNS
原理
DNS法,全称3,5二硝基水杨酸法，是一种用于测定总糖和还原糖含量的化学分析方法，该方法的测定原理是基于DNS试剂与还原糖共热后，会发生还原反应生成氨基化合物，此化合物在碱性环境中呈现桔红色，并在特定波长（540nm）下具有最大吸收峰，由于还原糖的含量与溶液的光吸收值呈线性关系，故可以通过比色法测量溶液的吸光度来计算样品中的含糖量。
试剂制备
（一）DNS试剂
将6.3g DNS与262mL 2mol/L的NaOH溶液混合，再加入500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，加入5g重蒸酚和5g亚硫酸氢钠，经过搅拌溶解后，冷却并定容至1000ml，制备完成的DNS试剂呈黄色，应贮存于棕色瓶中。
（二）1mg/mL葡萄糖标准溶液
首先准确称取经过80℃烘至恒重的分析纯无水葡萄糖1g，然后将其置于烧杯中，加入少量水进行溶解，为防止微生物生长，再加入5mL浓盐酸，以蒸馏水为介质，将溶液定容至1000ml，并充分混匀，将制备好的葡萄糖标准溶液保存在4℃的冰箱中，以备后用。
（三）碘 碘化钾溶液
需称取5g碘和10g碘化钾,并将其溶解在100mL蒸馏水中。
（四）酚酞指示剂
将1g酚酞溶解在250mL 70%的乙醇中。
（五）6mol/L盐酸溶液
首先取250mL浓盐酸,然后加入蒸馏水进行稀释，直至总体积达到500mL，并充分混匀。
实验步骤
（一）制作标准曲线
将6支试管进行编号,并参照表1所示，分别向各试管中加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水以及3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂，确保各管内容物充分混匀后，以0号管作为参照调零点，在540nm波长处测量1至5号管的吸光度，随后，以葡萄糖的毫克数为横坐标，以540nm处的吸光度（A540）为纵坐标，绘制出相应的标准曲线。
| 试管编号 | 葡萄糖标准液（mL） | 蒸馏水（mL） | DNS试剂（mL） |
|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 1 | 5 |
| 1 | 2 | 8 | 5 |
| 2 | 4 | 6 | 5 |
| 3 | 6 | 4 | 5 |
| 4 | 8 | 2 | 5 |
| 5 | 0 | 0 | 5 |
（二）测定食用面粉中的还原糖
准确称取2.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，加入少量蒸馏水搅拌成糊状，随后，再加入50 60mL蒸馏水，充分搅匀后，置于50℃的恒温水浴中保温20分钟，以确保还原糖能够充分浸出，将混合物转入100mL容量瓶中，定容至100ml，进行过滤，取适量的滤液进行还原糖的测定。
（三）样品总糖的水解和提取
将0.50g小麦面粉精确称量后，放入三角瓶中，随后，向瓶内加入10mL浓度为6mol/L的HCl溶液和15mL蒸馏水，确保样品被充分浸润，将三角瓶置于沸水浴中，加热并水解30分钟，完成后，取出一滴水解后的溶液置于白瓷板上，滴加碘液进行水解程度的检查，若淀粉已完全水解，则加碘后不呈现颜色，水解完成后，待溶液冷却，再向其中加入一滴酚酞指示剂，用6mol/L的NaOH溶液进行中和，直至溶液呈现微红色，之后，用蒸馏水将溶液定容至100mL，并进行过滤，从过滤后的溶液中吸取10mL至100mL的容量瓶中，再次定容至刻度，即得到稀释1000倍的样品水解液，可用于后续的总糖含量测定。
（四）样品糖含量测定
准备好7支25mm×250mm的试管，并进行编号，按照表2所示，分别向各试管中加入相应的试剂，测定完成后，取还原糖和总糖样品在波长A540处的平均吸光度值，通过查找标准曲线，可以得出相应的糖量，按照以下公式计算还原糖和总糖的含量。
| 试管编号 | 样品液（mL） | 蒸馏水（mL） | DNS试剂（mL） |
|---|---|---|---|
| 1 | 5 | 1 | 5 |
| 2 | 1 | 5 | 5 |
| 3 | 5 | 0 | 5 |
| 4 | 2 | 5 | |
| 5 | 5 | 5 | |
| 6 | 3 | 5 | |
| 7 | 3 | 5 |
结果计算
（一）还原糖含量计算
根据标准曲线,由样品液的吸光度值查出对应的葡萄糖毫克数，按下式计算还原糖含量： 还原糖（%）=（C×V×n）/（W×1000）×100% C为从标准曲线查得的葡萄糖毫克数，V为样品液体积，n为样品稀释倍数，W为样品质量。
（二）总糖含量计算
总糖含量（%）=（总糖水解液中葡萄糖毫克数×稀释倍数）/（样品质量×1000）×100%
注意事项
（一）实验操作方面
- 加热过程：在与DNS试剂反应过程中，加热时间和温度要严格控制，一般采用沸水浴加热，时间通常为5 10分钟，且要保证各试管受热均匀，如果加热时间不足或温度不够，反应不完全，会导致显色不足，使测定结果偏低；反之，过度加热可能会加速副反应的发生，影响测定的准确性。
- 取样准确性：在取样品和标准溶液时，要使用准确的移液器，确保取样量准确，即使是微小的取样误差，在后续计算中也可能导致较大的结果偏差，在制作标准曲线时，如果标准葡萄糖溶液的取样量不准确，会使绘制的标准曲线出现偏差，进而影响对样品中糖含量的准确判断。
- 混合均匀：在向试管中加入各种试剂后，要充分摇匀，使反应物混合均匀，否则，反应可能不完全，影响显色反应的一致性和准确性，特别是在加入DNS试剂和样品液后，若不充分混匀，可能会导致局部反应剧烈而其他部分反应不充分的情况。
（二）试剂使用方面
- DNS试剂保存：DNS试剂应储存在棕色瓶中，放置于阴暗处，因为DNS试剂见光易分解，如果保存不当，会导致试剂失效，影响测定结果的准确性，若将DNS试剂长时间暴露在强光下，其有效成分会逐渐减少，与还原糖反应时的显色程度会减弱，从而使测定的吸光度值偏低。
- 试剂现用现配：一些试剂如氢氧化钠溶液等，最好现用现配，长时间放置的氢氧化钠溶液可能会吸收空气中的二氧化碳而变质，影响反应体系的pH值，进而干扰测定结果，若使用变质的氢氧化钠配制的DNS试剂，可能会改变反应的条件，使显色反应不正常。
（三）仪器选择与校准方面
- 分光光度计的选择：应选择合适波长范围（能准确测量540nm波长处吸光度）且精度较高的分光光度计，不同型号的分光光度计在性能上可能存在差异，如波长准确性、吸光度测量精度等，如果分光光度计的波长偏差较大，会导致测量的吸光度值不准确，从而影响对糖含量的计算。
- 仪器校准：在使用分光光度计之前，必须进行校准，包括调零和调满度等操作，以确保仪器测量的准确性，若没有正确调零，会使所有测量的吸光度值都包含一个固定的误差，导致根据标准曲线计算出的糖含量出现偏差。
相关问题与解答
（一）问题
为什么DNS法测定还原糖时要在沸水浴中加热？
（二）解答
DNS与还原糖的反应需要在一定的温度条件下才能充分进行,在沸水浴中加热可以提供足够的能量，使反应快速达到平衡，促进DNS与还原糖之间的氧化还原反应，只有在较高的温度下，还原糖才能有效地将DNS还原为棕红色的氨基化合物，从而产生明显的颜色变化，以便在分光光度计下进行准确的定量测定，如果不进行加热或加热温度不够，反应速度会很慢，且反应可能不完全，导致显色不明显，影响测定结果的准确性和灵敏度。
（三）问题
在测定总糖时,为什么要先进行酸水解？
（四）解答
植物样品中的总糖包括多糖、双糖和单糖等多种形式，其中多糖和双糖不能直接与DNS反应显示出颜色变化，因为它们没有游离的还原基团，通过酸水解，可以将多糖和双糖水解为单糖，从而使所有的糖类都转化为具有还原性的单糖形式，这样就可以利用DNS法对这些水解后的单糖进行测定，从而计算出样品中总糖的含量，如果不进行酸水解，直接测定样品中的糖含量，只能测到原本就存在的单糖和部分具有还原性的双糖，而不能准确反映样品中总