DNS法测定酶活力及稀释方法详解
DNS法原理
DNS法（3,5二硝基水杨酸法）是一种常用的测定还原糖以及基于还原糖生成的酶活力的方法，其原理是基于在碱性条件下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度呈线性关系，通过在特定波长下（通常为540nm）测定吸光度，从而计算出还原糖的含量,进而推算出酶活力。
酶活力定义与计算
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用在一定条件下，单位时间内底物减少或产物生成的量来表示，在DNS法中，通过测定酶促反应产生的还原糖量来计算酶活力，一般以每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位（U），计算公式为：酶活力（U/mL）=（从标准曲线查得的还原糖含量×稀释倍数）/（反应时间×酶液体积）。
试剂准备
- DNS试剂：称取6.3g DNS和262mL 2mol/L氢氧化钠，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后定容至1000mL,储存于棕色瓶中备用。
- 标准葡萄糖溶液：准确称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，蒸馏水定容至100mL，即得1mg/mL的标准葡萄糖溶液，再分别稀释成不同浓度梯度，如0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL等,用于制作标准曲线。
- 缓冲液：根据所测酶的适宜pH选择合适的缓冲液，如测淀粉酶可用pH6.8 7.0的磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液。
- 底物溶液：例如测淀粉酶时，可配制1%的淀粉溶液，需现用现配,防止淀粉水解。
酶液稀释步骤
（一）初步稀释
- 取一定体积（如V₁）的待测酶液,置于干净的离心管或具塞试管中。
- 加入一定体积（如V₂）的缓冲液，充分混匀，使酶液初步稀释，稀释倍数为（V₁ + V₂）/V₁，取1mL酶液，加入9mL缓冲液,稀释倍数为10倍。
（二）梯度稀释（可选）
如果初步稀释后的酶液活力仍较高或较低，可进行梯度稀释。 |稀释次数|取上一步酶液体积（mL）|加入缓冲液体积（mL）|稀释倍数|最终稀释倍数（相对于原始酶液）| |||||| |1|1|9|10|10| |2|1|9|10|100| |3|1|9|10|1000|
测定操作流程
- 标准曲线制作：取不同浓度的标准葡萄糖溶液各1mL，分别加入DNS试剂1mL，沸水浴煮沸5分钟，冷却后用蒸馏水定容至适当体积（如25mL），在540nm波长下测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
- 酶促反应：取稀释后的酶液适量（如0.5mL）与底物溶液（如1%淀粉溶液1mL）混合，在适宜温度（如淀粉酶为37℃）下准确反应一定时间（如5分钟），立即加入DNS试剂1mL终止反应，并沸水浴煮沸5分钟,冷却后定容。
- 测定吸光度：以不加酶液的反应体系作为空白对照，在540nm波长下测定样品的吸光度,从标准曲线上查得还原糖含量。
注意事项
- DNS试剂应避光保存,防止分解失效。
- 酶促反应的条件（温度、时间、pH等）需严格控制,以保证结果的准确性。
- 比色测定时，应确保比色皿清洁，溶液无气泡,以免影响吸光度的测定。
相关问题与解答
问题1：为什么DNS法测定酶活力时要严格控制反应温度和时间？
答：酶的活性受温度和时间影响很大，温度过高或过低都会影响酶的催化效率，使反应速度改变，导致测定的还原糖量不准确，进而影响酶活力的计算，反应时间同样关键，时间过短，反应未充分进行，不能准确反映酶的催化能力；时间过长，底物可能被耗尽或出现其他副反应，也会使测定结果偏离真实值，只有严格控制反应条件,才能保证酶活力测定的准确性和可比性。
问题2：如果在DNS法测定中，吸光度超过了标准曲线的范围，应该怎么处理？
答：如果吸光度超过标准曲线范围，说明还原糖的量过高，此时可以将样品进行适当稀释后再测定吸光度，若原样品稀释了10倍，吸光度仍超出标准曲线上限，可再取一定体积（如0.5mL）的该样品，加入缓冲液进一步稀释（如加入4.5mL缓冲液，稀释10倍），然后重新测定吸光度，将结果乘以相应的稀释倍数计算还原糖含量和酶活力，在后续实验中，可适当调整酶液的稀释倍数，使测定值落在标准曲线范围内,以提高测定的准确性。
DNS法测定酶活力及合理的酶液稀释方法是准确获取酶活力数据的关键，操作过程中需严谨对待各个环节，以确保实验结果的