S 法测还原糖，需精准控制反应条件，注意样品处理，关注显色稳定性
,以下是关于DNS法测定还原糖的思考：
DNS法原理及特点
- 原理：在氢氧化钠存在下（碱性条件），还原糖与3,5 二硝基水杨酸（DNS）共热后被氧化生成糖酸，DNS则被还原为氨基化合物（3 氨基 5 硝基水杨酸），该化合物在过量的碱性溶液中呈棕红色，在540nm波长处有最大吸收峰，在一定浓度范围内，还原糖的量与吸光度值呈线性关系,据此可通过比色法测定样品中还原糖的含量。
- 特点
- 优点：检测浓度范围较宽，方法简便，便于还原糖大批量测定，且对还原糖的种类没有选择性,适合多糖水解产生的多种还原糖体系的测定。
- 缺点：仅适用于还原糖，若样品含有非还原糖需先水解处理；显色后需在较短时间内完成测定，否则颜色会逐渐消退；高温加热步骤可能导致部分糖类分解。
试剂制备与保存
- 试剂制备：将6.3克3,5 二硝基水杨酸和262ml 2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，即制成DNS试剂，也有其他类似的配方，如称量18.1992g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水中，加热，趁热加入0.6313g 3,5 二硝基水杨酸，另配制2mol/L NaOH溶液，取26.2ml加入上述溶液中，再称量0.5128g苯酚和0.5064g无水亚硫酸钠移入配置好的溶液中,蒸馏水定容至100ml。
- 保存方法：DNS试剂需贮于棕色瓶中放置一周后备用，且需避光冷藏,若出现结晶或浑浊则需重新配制。
标准曲线制作
- 操作步骤：分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于15 ml试管中，用蒸馏水补足至1.0ml，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min（也有实验确定最佳煮沸时间为30min），流水冷却，用水补足到15ml刻度，在520nm或540nm波长下测定吸光度，以葡萄糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
- 注意事项：标准曲线需每次实验重新制作，以避免试剂批次差异导致误差；在制作标准曲线和测定未知浓度时,煮沸时间必须相同。
样品测定
- 样品预处理：固体样品粉碎后溶解于蒸馏水，离心取上清液；液体样品直接稀释至合适浓度，若样品含有非还原糖，需加入盐酸水解,再用NaOH中和。
- 测定步骤：取稀释后的样品液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min（或根据实验确定的最佳时间），冷却后用水补足到15ml刻度，在520nm或540nm波长下测定吸光度，从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数,进而求出样品中糖含量。
影响因素及控制
| 影响因素 | 影响方式 | 控制措施 |
|---|---|---|
| 波长选择 | 不同波长下吸光度测量值不同，影响定量准确性 | 通过实验确定最佳吸收波长，一般选择540nm，测量时以DNS调零较准确 |
| DNS用量 | 用量过少反应不完全，过多会使测量时DNS溶液浓度过大造成测量不准 | 通过实验确定合适用量，如一般为2ml |
| 反应时间（水浴时间） | 时间不足反应不完全，过长可能导致糖类分解 | 精确控制煮沸时间，如实验确定的最佳时间 |
| 溶液酸度 | 碱性越强反应越完全，但无需刻意调节反应混合物溶液的pH值 | 保证测量时DNS试剂、糖的用量与制作标准曲线时相同即可 |
常见问题与解决
- 显色异常
- 颜色过浅：可能是加热时间不足或DNS试剂失效,建议现配现用试剂并确保沸水浴时间精确。
- 沉淀生成：可能是样品中含蛋白质或淀粉,需提前用乙醇或酶解法去除干扰物。
- 数据偏差
- 标准曲线问题：每次实验需重新制作标准曲线,避免试剂批次差异导致误差。
- 样品浓度问题：样品浓度过高时，吸光度可能超出线性范围,需调整稀释倍数。
相关问题与解答
- 问题1：DNS法测定还原糖时，为什么需要以DNS试剂调零？
- 解答：因为DNS试剂本身在测定波长下有一定的吸光度，且在不同浓度下其吸光度可能会对反应生成的氨基化合物吸光度的测量产生影响，以DNS试剂调零可以消除试剂本身的吸光度干扰，使测量结果更准确地反映还原糖与DNS反应生成的氨基化合物的吸光度，从而提高测定的准确性，例如在某些高浓度葡萄糖与少量DNS试剂反应的情况下，若不以DNS调零,可能会因DNS试剂的吸光度导致测量误差增大。
- 问题2：如果样品中含有多种还原糖，DNS法能否准确测定总还原糖含量？
- 解答：DNS法能够准确测定总还原糖含量，因为DNS法的原理是基于还原糖与DNS反应生成的氨基化合物的吸光度与还原糖的总量在一定范围内呈线性关系,且该方法对还原糖的种类没有选择性。