DNS试剂配制测还原糖
DNS试剂配制
（一）试剂组成与作用
DNS试剂主要由3,5 二硝基水杨酸（DNS）、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚和亚硫酸钠等成分组成，DNS在碱性条件下与还原糖发生氧化还原反应，生成棕红色的3 氨基 5 硝基水杨酸，是显色反应的关键物质；氢氧化钠提供碱性环境，促使反应进行；酒石酸钾钠起到稳定反应体系的作用；苯酚可增强显色效果；亚硫酸钠则用于防止DNS被氧化。
（二）配制步骤
| 步骤 | 注意事项 | |
|---|---|---|
| 称量 | 准确称取6.3克3,5 二硝基水杨酸，5克苯酚，5克亚硫酸钠 | 使用精确的电子天平，确保称量准确 |
| 溶解 | 将称好的3,5 二硝基水杨酸加入到262ml 2mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌使其溶解 | 搅拌过程要缓慢，避免溶液溅出 |
| 混合 | 将上述溶液加入到含有182克酒石酸钾钠的500ml热水溶液中，不断搅拌至完全溶解 | 热水温度要适中，防止溶液过热导致成分分解 |
| 定容 | 待溶液冷却后，加水定容到1000ml，转移至棕色瓶中 | 定容时要准确，棕色瓶可避光保存试剂 |
（三）试剂保存
DNS试剂应贮存于棕色瓶中,放置在阴凉避光处，一般配制完成后需放置一周后使用，且在使用过程中要注意密封，避免试剂与空气长时间接触而失效。
葡萄糖标准曲线的绘制
（一）葡萄糖标准溶液的配制
准确称取1.000克经80℃烘至恒重的分析纯无水葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，得到1mg/ml的葡萄糖标准溶液，配制过程中要确保葡萄糖完全溶解，溶液均匀。
（二）标准曲线的制作
| 试管编号 | 葡萄糖标准液（ml） | 蒸馏水（ml） | DNS试剂（ml） | 吸光度测定 |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 0 | 0 | 调零 |
| 1 | 2 | 8 | 0 | A₁ |
| 2 | 4 | 6 | 0 | A₂ |
| 3 | 6 | 4 | 0 | A₃ |
| 4 | 8 | 2 | 0 | A₄ |
| 5 | 0 | 0 | 0 | A₅ |
分别取不同体积的葡萄糖标准液于15ml试管中,用蒸馏水补足至1.0ml，然后分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度，以0号管为空白对照，在540nm波长下测定各管的吸光度，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
样品中还原糖的测定
（一）样品处理
对于固体样品,需将其粉碎后过筛，准确称取适量样品，用蒸馏水溶解并定容至一定体积，必要时进行离心或过滤，取上清液作为待测液，对于液体样品，根据其还原糖含量进行适当稀释，使糖浓度处于0.1 1.0mg/ml范围内。
（二）测定步骤
取稀释后的样品液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。
（三）结果计算
根据样品液的吸光度,在标准曲线上查出对应的葡萄糖质量（mg），按照以下公式计算样品中还原糖的含量：
还原糖含量（mg/g或mg/ml）=（从标准曲线查得的葡萄糖质量/样品体积）×样品稀释倍数
相关问题与解答
问题1：DNS试剂在使用一段时间后出现沉淀或颜色变化，还能继续使用吗？
答：如果DNS试剂出现沉淀或颜色明显变化，说明试剂可能已经失效或受到污染，不建议继续使用，此时应重新配制新鲜的DNS试剂，以保证测定结果的准确性。
问题2：在测定样品中还原糖时，如果样品颜色较深，对测定结果会有什么影响？该如何解决？
答：样品颜色较深可能会干扰吸光度的测定，使测定结果不准确，可以通过对样品进行脱色处理来解决，例如采用活性炭吸附法，具体操作是将适量活性炭加入到样品溶液中，搅拌均匀后过滤，取滤液进行测定。