S试剂使用时，需将待测液调至碱性，与DNS试剂混匀后沸水浴
DNS试剂的使用方法
DNS试剂简介
DNS试剂（3,5二硝基水杨酸法）主要用于定量检测植物组织样品中的总糖和还原糖含量，其检测原理基于还原糖在碱性条件下被氧化成糖酸，同时3,5二硝基水杨酸被还原为棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色产物的颜色深浅程度呈正比关系，通过测定540nm处的吸光度值，结合标准曲线可计算出样品中还原糖和总糖的含量。
（一）主要成分及浓度
| 成分 | 浓度（g/L） |
|---|---|
| 氢氧化钠 | |
| 3,5二硝基水杨酸 | 3 |
| 酒石酸钾钠 | |
| 酚 |
（二）储存条件
- 温度：2～8℃保存。
- 光照：尽量避光保存，防止试剂因光照而分解失效。
- 有效期：一般为12个月。
操作步骤
（一）还原糖的提取
- 样品准备：称取植物样品0.5 3g，剪碎后加入约3ml蒸馏水进行匀浆处理，将匀浆转移至烧杯或三角瓶中，并用12ml蒸馏水冲洗研磨器2 3次，洗出液一并转移至容器中。
- 水浴浸提：将装有样品的容器置于50℃水浴中保温30分钟，期间不时搅拌，使还原糖充分浸出。
- 离心分离：将沉淀和浸出液转移至50ml离心管中，以4000g离心5分钟，留取上清液，向沉淀中加入20ml蒸馏水，混匀后再次4000g离心5分钟。
- 定容：将两次获得的上清液合并，用蒸馏水定容至100ml，混匀后作为还原糖待测液。
（二）总糖的水解和提取
- 样品准备与水解：称取植物样品0.5 3g，剪碎后加入约3ml蒸馏水匀浆，转移至烧杯或三角瓶中，用12ml蒸馏水冲洗研磨器2 3次，洗出液也转移至该容器，向容器中加入10ml 6M盐酸溶液，搅拌均匀后煮沸30分钟，并不时搅拌。
- 检查水解程度：取2滴反应液滴加于载玻片上，再滴加1滴显色液，若不显示蓝色，则表明水解完全。
- 调pH与定容：水解完毕后冷却至室温，加入6M氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.4左右，用蒸馏水定容至100ml，混匀后4000g离心5分钟或过滤，获得上清或滤液，取上清或滤液10ml，用蒸馏水定容至100ml，得到稀释10倍的总糖水解液（提取液），取1ml总糖水解液用于测定其还原糖含量。
（三）制作葡萄糖标准曲线
- 配制标准溶液：准确称取干燥至恒重的葡萄糖适量，用蒸馏水溶解并定容至一定体积，配制成一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液，可配制浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的标准溶液。
- 添加试剂与反应：取干净离心管或试管，分别加入1ml不同浓度的葡萄糖标准溶液，再各加入2ml DNS试剂，将各管混匀后，在沸水浴中加热5分钟，然后立即冷却至室温。
- 测定吸光度：以0号管调零，在540nm处测定各管的吸光度值。
- 绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，各标准浓度（mg/ml）为横坐标作图，得到葡萄糖标准曲线。
（四）还原糖测定
- 取样与加试剂：取制备好的还原糖提取液或总糖水解液1ml，加入DNS试剂2ml。
- 反应与冷却：将混合液在沸水浴中加热5分钟，然后取出立即冷却至室温。
- 测定吸光度：在540nm处测定各管的吸光度值，根据标准曲线计算出样品中还原糖的含量。
注意事项
（一）安全事项
- 避免试剂与手接触,因为DNS试剂具有强腐蚀性，若皮肤不慎接触，应立即用大量清水冲洗。
- 在稀释盐酸和氢氧化钠溶液时,需格外小心操作，以防伤人。
（二）试剂使用规范
- DNS试剂应避免反复冻融,以免失效或效率下降。
- 已取出的试剂不能再放回原试剂瓶内,防止试剂污染。
- 实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存，以免变质。
- 使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
- 加入试剂的顺序要一致,以保证所有反应板孔温育的时间相同。
（三）样本处理要求
- 如果待测样本不能及时测定,应置于2 8℃保存，且需在3天内完成测定。
- 如果样品还原糖浓度过高,应用蒸馏水稀释后重新测定，结果需乘以稀释倍数。
相关问题与解答
（一）问题1：为什么DNS试剂要避光保存？
答：DNS试剂中的3,5二硝基水杨酸等成分在光照下容易发生分解反应，导致试剂的有效成分减少，从而影响检测结果的准确性和可靠性，为了避免试剂因光照而失效，需要将其存放在避光的环境中，如棕色瓶内，并置于2 8℃的冰箱中保存。
（二）问题2：在制作葡萄糖标准曲线时，为什么要以0号管调零？
答：0号管中不含葡萄糖标准溶液，只加入了DNS试剂和其他反应物质，以0号管调零可以消除试剂本身颜色以及其他非葡萄糖因素对吸光度测定的影响，使得测定的吸光度值能够真实反映葡萄糖与DNS试剂反应产生的颜色变化，
