DNS法基于3,5二硝基水杨酸与还原糖共热显棕红色,540nm比色定量,操作简便快速,适用于葡萄糖等还原糖检测
葡萄糖测定DNS法详解
DNS法(二硝基水杨酸法)是基于还原糖与3,5二硝基水杨酸(DNS)在碱性条件下的显色反应,通过比色法定量检测葡萄糖含量,其核心反应为:在沸水浴条件下,DNS与葡萄糖的醛基发生氧化还原反应,生成棕红色的3氨基5硝基水杨酸化合物,该产物在特定波长下具有特征吸光度,该方法适用于所有含游离醛基的还原糖(如葡萄糖、果糖),但不适用于蔗糖等非还原糖。
关键反应条件
- 波长选择:产物最大吸光度在540nm处(部分文献提及520nm,可能因仪器差异略有调整)。
- 碱性环境:需在NaOH存在下促进反应进行。
- 加热条件:煮沸510分钟以确保反应完全。
测定步骤
样品预处理
- 固体样品:粉碎后按比例(如1:10)溶于蒸馏水,离心取上清液。
- 液体样品:直接稀释至合适浓度(建议葡萄糖浓度在0.11.0 mg/mL范围内)。
试剂配制
- DNS试剂(现用现配): | 成分 | 用量 | ||| | 二硝基水杨酸 | 1g | | 氢氧化钠 | 20g | | 苯酚 | 0.5g | | 亚硫酸钠(无水) | 0.2g | | 蒸馏水定容至 | 100mL |
反应与显色
- 取待测液、葡萄糖标准液各1mL,分别加入DNS试剂2mL,混匀。
- 沸水浴加热510分钟,立即冷水冷却至室温。
- 定容至25mL(或统一体积),摇匀后测吸光度。
比色测定
- 空白对照:以蒸馏水代替样品,同步操作。
- 使用分光光度计在540nm处测量吸光度(OD值)。
标准曲线制作
葡萄糖浓度(mg/mL) | 吸光度(OD₅₄₀) |
---|---|
1 | 125 |
2 | 250 |
4 | 500 |
6 | 750 |
8 | 000 |
0 | 250 |
注意:实际实验需根据样品浓度调整标准液范围,并确保R²>0.99以保证线性关系。
试剂与仪器要求
试剂保存
- DNS试剂需避光保存,常温下可稳定约1周。
- 葡萄糖标准液应冷藏(4℃)保存,防止微生物污染。
仪器参数
- 分光光度计:预热至少15分钟,校正空白后测量。
- 沸水浴装置:需能精确控制加热时间(推荐定时器)。
特点与局限性
优势
- 操作简便:无需复杂萃取或衍生化步骤。
- 灵敏度高:最低检出限可达0.01mg/mL。
- 经济性:试剂成本低,适合常规检测。
局限
- 选择性限制:仅适用于还原糖,蔗糖等需预水解。
- 干扰因素:蛋白质、酚类物质可能产生颜色干扰。
应用实例
- 生物燃料监控:检测发酵液中葡萄糖残留量,优化乙醇产率。
- 食品工业:果汁、蜂蜜中还原糖含量测定。
问题与解答
Q1:为何选择540nm作为检测波长?
A1:棕红色产物3氨基5硝基水杨酸在540nm处有最大吸光度,此波长下干扰物质(如叶绿素)的吸收较弱,可提高检测特异性。
Q2:如何检测含蔗糖的样品?
A2:需先用盐酸或无机酸将蔗糖水解为葡萄糖和果糖(如:1mol/L HCl,10℃煮沸30分钟),再中和至中性后进行DNS