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葡萄糖测定DNS法详解

DNS法（二硝基水杨酸法）是基于还原糖与3,5二硝基水杨酸（DNS）在碱性条件下的显色反应，通过比色法定量检测葡萄糖含量，其核心反应为：在沸水浴条件下，DNS与葡萄糖的醛基发生氧化还原反应，生成棕红色的3氨基5硝基水杨酸化合物，该产物在特定波长下具有特征吸光度，该方法适用于所有含游离醛基的还原糖（如葡萄糖、果糖），但不适用于蔗糖等非还原糖。

关键反应条件

• 波长选择：产物最大吸光度在540nm处（部分文献提及520nm，可能因仪器差异略有调整）。
• 碱性环境：需在NaOH存在下促进反应进行。
• 加热条件：煮沸510分钟以确保反应完全。

测定步骤

样品预处理

• 固体样品：粉碎后按比例（如1:10）溶于蒸馏水，离心取上清液。
• 液体样品：直接稀释至合适浓度（建议葡萄糖浓度在0.11.0 mg/mL范围内）。

试剂配制

• DNS试剂（现用现配）： | 成分 | 用量 | ||| | 二硝基水杨酸 | 1g | | 氢氧化钠 | 20g | | 苯酚 | 0.5g | | 亚硫酸钠（无水） | 0.2g | | 蒸馏水定容至 | 100mL |

反应与显色

• 取待测液、葡萄糖标准液各1mL，分别加入DNS试剂2mL，混匀。
• 沸水浴加热510分钟，立即冷水冷却至室温。
• 定容至25mL（或统一体积），摇匀后测吸光度。

比色测定

• 空白对照：以蒸馏水代替样品，同步操作。
• 使用分光光度计在540nm处测量吸光度（OD值）。

标准曲线制作

注意：实际实验需根据样品浓度调整标准液范围，并确保R²>0.99以保证线性关系。

试剂与仪器要求

试剂保存

• DNS试剂需避光保存,常温下可稳定约1周。
• 葡萄糖标准液应冷藏（4℃）保存，防止微生物污染。

仪器参数

• 分光光度计：预热至少15分钟，校正空白后测量。
• 沸水浴装置：需能精确控制加热时间（推荐定时器）。

特点与局限性

优势

• 操作简便：无需复杂萃取或衍生化步骤。
• 灵敏度高：最低检出限可达0.01mg/mL。
• 经济性：试剂成本低，适合常规检测。

局限

• 选择性限制：仅适用于还原糖，蔗糖等需预水解。
• 干扰因素：蛋白质、酚类物质可能产生颜色干扰。

应用实例

• 生物燃料监控：检测发酵液中葡萄糖残留量，优化乙醇产率。
• 食品工业：果汁、蜂蜜中还原糖含量测定。

问题与解答

Q1：为何选择540nm作为检测波长？

A1：棕红色产物3氨基5硝基水杨酸在540nm处有最大吸光度，此波长下干扰物质（如叶绿素）的吸收较弱，可提高检测特异性。

Q2：如何检测含蔗糖的样品？

A2：需先用盐酸或无机酸将蔗糖水解为葡萄糖和果糖（如：1mol/L HCl，10℃煮沸30分钟），再中和至中性后进行DNS