5154

DNS酶活计算方法

DNS法原理

DNS（3,5二硝基水杨酸）法是一种用于测定还原糖含量的常用方法，其原理是基于在碱性条件下，DNS与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度呈线性关系，可在特定波长下通过比色测定吸光度，进而计算出还原糖的含量,而酶活力的计算通常是基于酶催化底物生成还原糖的量来确定的。

实验步骤

1. 葡萄糖标准曲线的制作

   • 试剂准备：准确称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，加水溶解并定容至100mL，得到1mg/mL的葡萄糖标准溶液，配制pH4.8的磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液以及DNS试剂（将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后定容至1000mL）。
   • 标准曲线绘制：取6支试管，编号,按照下表加入试剂：

   试管号	1	2	3	4	5	6
   1mg/ml葡萄糖标准液/ml	0	1	2	3	4	5
   蒸馏水量/ml	5	4	3	2	1	0
   葡萄糖浓度/mg/ml	0	2	4	6	8	1
   PH4.8磷酸氢二钠 柠檬酸/ml	5	5	5	5	5	5
   DNS试剂/ml	3	3	3	3	3	3

   将各管摇匀，在沸水浴中加热7min，然后迅速冷却至室温，再向每管加入5mL蒸馏水，摇匀，以1号管为空白对照，在530nm波长下用分光光度计测定各管的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

   

2. 酶活测定

   • 样品制备：将待测酶液适当稀释，使其酶活力在标准曲线的线性范围内，取一定量的稀释酶液，加入适量的底物（如淀粉等），在适宜的温度和pH条件下反应一定时间,使酶促反应充分进行。
   • 灭酶与显色：到达反应时间后，立即向反应体系中加入DNS试剂，以终止酶反应，并在沸水浴中加热一定时间（通常与制作标准曲线时的加热时间相同），使DNS与生成的还原糖充分反应，冷却至室温后,加入适量蒸馏水稀释。
   • 吸光度测定：以空白对照（通常为不加底物的反应体系）为参比，在与制作标准曲线相同的波长（如530nm）下测定样品的吸光度。

酶活计算

1. 根据标准曲线求出还原糖含量：通过测定的吸光度值，在葡萄糖标准曲线上查找对应的还原糖浓度（mg/mL）。
2. 计算酶活力单位：酶活力单位通常定义为在一定条件下，每分钟催化底物生成1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位（U），计算公式为：酶活力（U/mL）=（还原糖浓度×反应体系体积×稀释倍数）/（反应时间×酶液体积）

若测定的吸光度对应的还原糖浓度为0.5mg/mL，反应体系总体积为10mL，稀释倍数为10倍，反应时间为30min，酶液体积为0.1mL,则酶活力计算如下：

首先将还原糖浓度换算成μmol/mL，已知葡萄糖的摩尔质量为180g/mol，则0.5mg/mL = 0.5 / 180 × 1000 μmol/mL ≈ 2.78μmol/mL。

酶活力（U/mL）=（2.78μmol/mL×10mL×10）/（30min×0.1mL）= 926.67U/mL

注意事项

1. 实验操作准确性：在吸取各种试剂时，要使用精确的移液器，确保移液的准确性和一致性,以减少实验误差。
2. 反应条件控制：严格控制酶促反应的温度、pH和反应时间等条件，确保反应在最适条件下进行,以保证酶活力测定结果的准确性和可比性。
3. 标准曲线的可靠性：制作葡萄糖标准曲线时，要保证标准品的纯度和浓度准确性，同时每次测定都应重新制作标准曲线,以消除实验条件变化带来的影响。

相关问题与解答

问题1：为什么在DNS法中要进行沸水浴加热？

解答：在DNS法中，沸水浴加热有两个重要作用，一是使DNS与还原糖在碱性条件下充分反应，生成棕红色的氨基化合物，以便进行比色测定；二是通过高温使酶失活，终止酶促反应，确保反应体系在测定过程中不再发生变化，从而准确测定某一时刻生成的还原糖含量,进而计算出酶活力。

问题2：如果样品的吸光度超出了标准曲线的范围,应该如何处理？

解答：如果样品的吸光度超出了标准曲线的范围，说明样品中的还原糖浓度过高或过低，对于浓度过高的情况，可以将样品进行适当稀释后再进行测定，使稀释后的样品吸光度落在标准曲线的范围内,然后根据稀释倍数计算出原样品的还原糖浓度和酶活力；