糖标准曲线DNS法中，用系列浓度麦芽糖溶液与DNS试剂反应，测吸光度绘制，用于定量还原
麦芽糖标准曲线（DNS法）
原理
淀粉酶催化产生的还原糖（如麦芽糖等）能使3,5 二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的3 氨基 5 硝基水杨酸，在特定波长下，该产物的吸光度与还原糖含量呈线性关系，通过配制一系列已知浓度的麦芽糖标准溶液，测定其与DNS反应后的吸光度，绘制标准曲线，当测定未知样品中麦芽糖含量时，在相同条件下测得吸光度后，即可从标准曲线上查得对应的麦芽糖浓度，从而实现对麦芽糖的定量分析。
试剂配制
（一）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）
精确称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100mL。
（二）3,5 二硝基水杨酸（DNS）试剂
- 配方：称取6.3g的3,5 二硝基水杨酸，21.0g氢氧化钠，182.0g酒石酸钾钠，5.0g结晶酚，5.0g亚硫酸钠。
- 配制步骤：先配制500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液；再配制262mL的2mol/L NaOH溶液；将氢氧化钠、3,5 二硝基水杨酸依次加入酒石酸钾钠热水溶液中，搅拌溶解；然后加入在50℃水中融化的结晶酚和亚硫酸钠，继续搅拌至完全溶解，待冷却后，转入到1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用，若溶液混浊可过滤后使用。
（三）柠檬酸缓冲液（100mmol/L，pH5.6）
- 母液A（200mmol/L柠檬酸）：称取42.03g C₆H₈O₇·H₂O₂，用蒸馏水溶解、定容至1000mL。
- 母液B（200mmol/L柠檬酸钠）：称取58.82g Na₃C₆H₅O₇·2H₂O₂，用蒸馏水溶解、定容至1000mL。
- 工作液：取27.5mL母液A与72.5mL母液B，混匀，调节pH至5.6，用蒸馏水稀释至200mL。
标准曲线制作步骤
（一）取试管编号
取7支具塞刻度试管,编号为0 6。
（二）加样
按表1所示加入试剂：
| 试管编号 | 麦芽糖标准溶液（mL） | 蒸馏水（mL） | DNS试剂（mL） |
|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 0 | 5 |
| 1 | 2 | 8 | 5 |
| 2 | 4 | 6 | 5 |
| 3 | 6 | 4 | 5 |
| 4 | 8 | 2 | 5 |
| 5 | 0 | 0 | 5 |
| 6 | 2 | 0.2 | 5 |
（三）反应与测定
- 摇匀各试管,置沸水浴中煮沸5min。
- 取出后流水冷却,加蒸馏水至20mL。
- 以0号管作为空白调零,在波长540nm处比色测定各管吸光度值。
（四）绘制标准曲线
以麦芽糖含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程。
注意事项
（一）试剂方面
- DNS试剂是强碱性试剂,配制时要注意安全，防止溅到皮肤和眼睛。
- 试剂应贮存在棕色瓶中,避免光照导致变质，且盖紧瓶塞，勿使CO₂进入。
- 麦芽糖标准溶液应现用现配,防止长时间放置变质影响标准曲线准确性。
（二）操作方面
- 加样时要准确,使用移液器或刻度吸管，减少误差。
- 沸水浴加热时间要严格控制,确保反应充分且各管反应条件一致。
- 比色测定时,要保证比色皿清洁干净，避免杂质影响吸光度测定。
（三）数据处理方面
- 每个浓度的麦芽糖标准溶液最好做多次重复实验,取平均值计算吸光度，以提高标准曲线的准确性和可靠性。
- 绘制标准曲线时,要检查数据的线性相关性，若线性不佳，应分析原因并重新实验。
相关问题与解答
（一）问题
为什么选择540nm波长进行比色测定？
（二）解答
因为在DNS法中,淀粉酶催化产生的还原糖与3,5 二硝基水杨酸反应生成的棕红色3 氨基 5 硝基水杨酸在540nm波长处有最大吸收峰，此波长下测定的吸光度值能准确反映还原糖的含量，所以选择540nm波长进行比色测定。
（一）问题
如果样品颜色较深,对测定结果有什么影响？如何消除？
（二）解答
如果样品颜色较深,会在比色测定时引入额外的吸光度，导致测定结果偏高，为了消除这种影响，可以采用以下方法：一是对样品进行适当稀释，使其颜色变浅；二是在测定时设置样品空白对照，即取相同体积的样品溶液，不加DNS试剂，其他操作相同，然后在计算时减去样品空白的吸光度值，以消除样品本身颜色对测定结果的