DNS法通过显色反应定量测定蛋白质，利用碱性条件与肽键作用生成棕红色化合物，比色
DNS法测定蛋白质的详细原理与操作
DNS法
DNS法（3,5二硝基水杨酸法）是一种基于还原糖与碱性条件下的3,5二硝基水杨酸（DNS）反应生成棕红色络合物的显色反应，常用于多糖或还原糖的定量分析，在蛋白质测定中，DNS法的应用需结合特定前处理步骤（如酸水解或酶解），将蛋白质降解为游离氨基酸或多肽后再进行测定，本文以酸水解法为例,详细介绍DNS法在蛋白质含量测定中的应用。
测定原理
- 蛋白质水解：
在高温酸性条件下（如6 mol/L HCl，110℃水解24小时），蛋白质被完全分解为游离氨基酸。 - DNS显色反应：
水解液中的还原性氨基酸（如赖氨酸、精氨酸等含游离氨基的氨基酸）在碱性条件下与DNS试剂反应，生成棕红色络合物（λmax=540 nm），其吸光度与氨基酸浓度成正比。 - 定量依据：
通过标准曲线法（以已知浓度的氨基酸或蛋白质水解产物为标样）,计算样品中蛋白质含量。
试剂与材料
| 试剂 | 配制方法 |
|---|---|
| 6 mol/L HCl溶液 | 取浓盐酸（密度1.18 g/mL）50 mL，加水定容至100 mL。 |
| 4% NaOH溶液 | 称取4 g NaOH，溶于100 mL蒸馏水。 |
| DNS试剂 | 称取1 g DNS溶于20 mL 2 mol/L NaOH溶液，加水定容至100 mL，避光保存。 |
| 葡萄糖标准溶液（1 mg/mL） | 精确称取100 mg葡萄糖（干燥至恒重），溶于100 mL蒸馏水。 |
| 待测蛋白质样品 | 精确称取样品（如酪蛋白）10~20 mg，加入6 mol/L HCl 30 mL，真空封管水解24小时。 |
操作步骤
- 水解与中和：
- 水解后样品冷却至室温，用4% NaOH溶液调节pH至7~8。
- 转移至50 mL容量瓶，定容后过滤，取滤液备用。
- 标准曲线制作：
取7支试管，按表1加入试剂：
| 试管编号 | 葡萄糖标准液（mL） | 蒸馏水（mL） | DNS试剂（mL） | 沸水浴时间（min） | 吸光度（A540） |
|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 0 | 5 | 5 | 000 |
| 1 | 2 | 8 | 5 | 5 | 125 |
| 2 | 4 | 6 | 5 | 5 | 250 |
| 3 | 6 | 4 | 5 | 5 | 375 |
| 4 | 8 | 2 | 5 | 5 | 500 |
| 5 | 0 | 0 | 5 | 5 | 625 |
| 6 | 样品滤液（0.5 mL） | 5 | 5 | 5 | Ax |
- 显色与测定：
- 各管加DNS试剂后混匀，沸水浴5分钟，冷水冷却，定容至25 mL。
- 以0号管调零，于540 nm处测吸光度。
- 计算蛋白质含量：
- 根据标准曲线回归方程（A= kC + b），计算样品中葡萄糖浓度（C葡萄糖）。
- 换算为蛋白质含量：
[ \text{蛋白质含量（mg）} = \frac{C{\text{葡萄糖}} \times V{\text{总}} \times f}{m \times 1000} ]
（f为氨基酸与蛋白质的转换系数，如酪蛋白f=6.38；V总为水解液总体积；m为样品质量）
注意事项
- 水解条件控制：
HCl浓度需准确，水解温度需恒定（±1℃），否则影响氨基酸回收率。
- DNS试剂保存：
避光冷藏，若颜色变深则弃去。
- 干扰排除：
水解液需除尽HCl，避免酸性环境干扰显色反应。
- 适用性限制：
仅适用于含游离氨基的氨基酸总量测定,无法区分具体氨基酸种类。
方法优缺点对比
| 方法 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|
| DNS法 | 操作简便、成本低；可批量检测。 | 需水解处理，耗时长；灵敏度低于Folin法。 |
| Folin酚法 | 灵敏度高；无需水解。 | 试剂稳定性差；易受酚类物质干扰。 |
| 双缩脲法 | 快速；适用于高浓度蛋白。 | 灵敏度低；受缓冲体系干扰。 |
应用实例
某奶粉中蛋白质含量测定：
- 称取样品1.200 g，按上述方法水解并测定，得Ax=0.480。
- 代入标准曲线方程（A=0.625C +0.000），计算C葡萄糖=0.768 mg/mL。
- 蛋白质含量= (0.768 ×50 ×6.38)/(1.200×1000) =5.32%（w/w）。
问题与解答
Q1：DNS法测定蛋白质时，为何需严格控制水解时间？
A1：水解时间不足会导致蛋白质降解不完全，氨基酸释放不充分；时间过长则可能破坏氨基酸（如丝氨酸、苏氨酸脱水），均会影响测定准确性。
Q2：如何减少DNS法中的干扰物质（如酮糖、色素）对结果的影响？
A2：可通过以下措施降低干扰：
- 样品预处理：用活性炭吸附色素或离心去除沉淀；
- 设置空白对照：以同体积蒸馏水代替DNS试剂，扣除背景吸光度；
- 选择特异性显色条件：优化pH和反应时间，增强目标物显色特异性