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DNS法测定西瓜中还原糖含量的实验研究

实验目的

1. 掌握3,5二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖的原理与操作
2. 建立西瓜果实中还原糖含量的定量检测方法
3. 了解植物材料中可溶性糖的提取与纯化技术

实验原理

（一）DNS法反应机理

3,5二硝基水杨酸在碱性条件下与还原糖共热（沸水浴）时,发生氧化还原反应：

• 还原糖将硝基还原为氨基
• 生成红棕色的3氨基5硝基水杨酸络合物
• 在540nm波长处具有特征吸收峰
• 吸光度与还原糖含量呈正相关

（二）西瓜糖分特点

实验材料与仪器

（一）材料准备

1. 市售西瓜品种：选用成熟度一致的"早春红玉"品种
2. 样本处理：取果肉去表皮及近皮层，液氮速冻后80℃保存

（二）试剂配制

DNS试剂配制 | 组分 | 用量 | ||| | 氢氧化钠 | 10g | | 酒石酸钾钠 | 182g | | 3,5二硝基水杨酸 | 6.3g | | 苯酚 | 5g | | 亚硫酸钠 | 5g | | 蒸馏水 | 定容至1000mL | 保存条件：棕色瓶4℃避光保存，有效期2周

标准溶液制备

• 葡萄糖标准储备液（1mg/mL）：精确称取100mg分析纯葡萄糖，定容至100mL
• 系列标准溶液：0.1/0.2/0.4/0.6/0.8/1.0mg/mL梯度

（三）仪器设备

实验步骤

（一）标准曲线制作

1. 取7支具塞刻度试管按表1加入试剂
2. 各管补加蒸馏水至2mL
3. 沸水浴5min后立即冰浴冷却
4. 定容至25mL，摇匀
5. 空白管调零，540nm测OD值

表1 葡萄糖标准曲线制备体系 | 管号 | 葡萄糖标准液(mL) | 蒸馏水(mL) | DNS(mL) | 最终浓度(mg/mL) | |||||| | 0 | 0 | 1 | 1.5 | 0 | | 1 | 0.2 | 0.8 | 1.5 | 0.1 | | 2 | 0.4 | 0.6 | 1.5 | 0.2 | | ... | ... | ... | ... | ... | | 6 | 1.2 | 0.2 | 1.5 | 0.6 |

（二）样品制备

1. 可溶性糖提取：

   • 称取5g西瓜果肉，液氮研磨成匀浆
   • 转入50mL离心管，加20mL 80%乙醇
   • 80℃水浴振荡提取30min
   • 4000rpm离心10min，收集上清液
   • 残渣重复提取2次，合并上清液

2. 纯化处理：

   • 上清液45℃旋转蒸发至约5mL
   • 转入预先处理好的C18固相萃取柱（甲醇活化）
   • 用3mL超纯水洗脱，收集洗脱液
   • 45μm滤膜过滤，待测

（三）样品测定

1. 取9支试管，1支加蒸馏水作空白对照
2. 其余8支分别加入不同体积样品液（需预试确定合适取样量）
3. 各管补加DNS试剂至总体积2mL
4. 后续操作同标准曲线制作
5. 根据OD值计算样品浓度

数据处理与结果分析

（一）标准曲线绘制

将表1数据进行线性回归，得到标准方程： [ y = 0.685x + 0.012 \quad (R^2 = 0.9993) ] 式中：y为吸光度，x为葡萄糖浓度（mg/mL）

（二）样品浓度计算

通过标准曲线计算样品中还原糖浓度： [ C{\text{样}} = \frac{(A{\text{样}} A_0)}{K} \times n ]

• ( A_{\text{样}} )：样品吸光度
• ( A_0 )：空白吸光度
• ( K )：标准曲线斜率（此处为0.685）
• ( n )：稀释倍数

（三）含量换算

西瓜中还原糖含量计算公式： [ W(\%) = \frac{C \times V \times 10^{3}}{M} \times 100\% ] 参数说明：

• ( C )：测得糖浓度（mg/mL）
• ( V )：样品定容体积（mL）
• ( M )：样品质量（g）

注意事项

1. 显色控制：沸水浴时间严格控制在5±0.5min，超过会导致颜色过深
2. pH影响：样品提取液pH应控制在78，强酸环境会破坏DNS结构
3. 干扰排除：提取液需除蛋白（可用Sevag法），避免浑浊影响读数
4. 比色时效：显色后应在30分钟内完成比色，防止颜色继续加深
5. 玻璃仪器：所有容器需用铬酸洗液浸泡，避免微量金属离子干扰

实验结果示例

表2 西瓜还原糖测定数据 | 样品编号 | 取样量(mL) | 吸光度(A) | 浓度(mg/mL) | 含量(mg/g) | |||||| | S1 | 0.5 | 0.315 | 0.412 | 8.24 | | S2 | 0.5 | 0.328 | 0.438 | 8.76 | | S3 | 0.5 | 0.309 | 0.398 | 7.96 | | 平均值 | | | 0.416 | 8.32 |

相关问题与解答

Q1：DNS法与斐林试剂法的主要区别是什么？ A：两者均基于还原糖的氧化还原反应,但：

• 反应条件：DNS法在单一溶液中完成，斐林法需现用现配的碱性酒石酸铜甲/乙液
• 检测范围：DNS法线性范围更广（01.5mg/mL），斐林法仅限低浓度
• 终点判断：DNS法通过比色定量，斐林法依赖砖红色沉淀的出现与否
• 适用性：DNS法适用于批量样品检测，斐林法多用于定性检验

Q2：如何验证西瓜提取液中不含干扰物质？ A：可通过以下方法验证：

1. 空白对照：用蒸馏水代替样品进行全程操作，OD值应<0.02
2. 回收率实验：添加已知量的标准葡萄糖，回收率应在95105%之间
3. 光谱扫描：在400700nm范围扫描，最大吸收峰应稳定在540nm左右
4. 平行对比：采用HPLC法进行对照检测，结果差异应