DNS试剂与还原糖反应显色，吸光度随浓度递增，可用于绘制标准曲线
DNS试剂法测定还原糖含量实验详解
实验原理
1 还原糖与DNS试剂的反应机制
DNS（3,5二硝基水杨酸）试剂在强碱性条件下与还原糖共热，发生氧化还原反应，还原糖的游离醛基或酮基将硝基苯酚还原为棕红色的氨基化合物（3氨基5硝基水杨酸），在540nm波长处具有特征吸收峰，该反应的显色强度与还原糖含量呈正相关,可实现定量检测。
2 比色法定量基础
根据朗伯比尔定律，溶液吸光度与物质浓度成正比，通过建立葡萄糖标准曲线，可推算待测样品中还原糖的浓度，本法检测限为0.021.5mg/mL，适用于植物提取液、发酵液等复杂体系中还原糖的快速检测。
试剂配制与材料准备
1 主要试剂配方
| 试剂名称 | 配制方法 |
|---|---|
| DNS试剂 | 称取1g DNS溶于20mL 1mol/L NaOH，加50mL蒸馏水，再定容至100mL（现用现配） |
| 葡萄糖标准液 | 精确称取100mg分析纯葡萄糖，溶解定容至100mL，得1mg/mL母液 |
| 盐酸溶液 | 量取8.3mL浓盐酸，定容至100mL（用于终止酶促反应） |
| 氢氧化钠溶液 | 称取4g NaOH溶于100mL蒸馏水（调节pH用） |
2 实验器材清单
- 可见分光光度计（配备540nm滤光片）
- 恒温水浴锅（带沸水浴功能）
- 具塞刻度试管（建议使用15mm×150mm规格）
- 微量移液器（20200μL、2001000μL各一支）
- 容量瓶（50mL、100mL）
- 冰浴槽（可选,用于快速终止反应）
标准曲线制作流程
1 梯度稀释标准液配制
取7支洁净试管按表1进行梯度稀释：
| 管号 | 葡萄糖母液(mL) | 蒸馏水(mL) | 终浓度(mg/mL) |
|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 1 | 0 |
| 1 | 2 | 8 | 2 |
| 2 | 4 | 6 | 4 |
| 3 | 6 | 4 | 6 |
| 4 | 8 | 2 | 8 |
| 5 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | 2 | 0.2 | 2 |
2 显色反应操作步骤
- 向各管加入1.5mL DNS试剂，立即摇匀
- 沸水浴加热5分钟（精确计时）
- 流水冷却至室温（约15分钟）
- 用蒸馏水定容至25mL，混匀
- 以0号管调零，测定540nm处吸光值
3 标准曲线绘制要点
- 使用Origin/Excel进行线性回归
- 典型标准曲线方程示例：y=0.587x+0.003 (R²≥0.999)
- 有效线性范围：0.21.2mg/mL
- 每日需新制标准曲线，避免试剂时效误差
样品测定操作规范
1 样品前处理要求
- 植物材料需研磨成匀浆，按1:10(w/v)添加提取液（乙醇:水=85:15）
- 发酵液需离心（4000rpm,10min）取上清液
- 蛋白质沉淀处理：加入等体积5%CuSO₄溶液，3000rpm离心5min
2 显色反应关键步骤
取待测液0.5mL + DNS试剂1.5mL → 立即混匀 2. 沸水浴准确计时5±0.5分钟 3. 冰浴骤冷（可选加速冷却） 4. 定容至25mL后静置10分钟比色
3 数据记录格式示例
| 样品编号 | 吸光值(A540) | 浓度(mg/mL) | RSD(%) |
|---|---|---|---|
| S1 | 352 | 56 | 2 |
| S2 | 365 | 59 | 5 |
| S3 | 348 | 54 | 8 |
结果计算与误差控制
1 含量计算公式
[ \text{还原糖含量(mg/g)} = \frac{C \times V_1}{W \times V_2} \times 100\% ]
- C：标准曲线查得浓度(mg/mL)
- V₁：提取液总体积(mL)
- W：样品干重(g)
- V₂：测定时取样体积(mL)
2 精密度控制措施
- 移液器校准：每月用分析天平校验（允许误差±0.5%）
- 比色皿配套性检测：ΔA≤0.005 at 540nm
- 平行样设置：每样品至少3次重复，RSD应<2%
应用实例与数据分析
1 典型检测数据解析
某苹果汁样品三次平行测定结果：
- A₅₄₀值：0.482、0.476、0.488
- 平均浓度：0.82mg/mL（标准曲线方程y=0.65x+0.002）
- 换算为果汁含糖量：8.2g/100mL
2 异常数据处理原则
| 异常类型 | 判断标准 | 处理方法 |
|---|---|---|
| 吸光值超线性范围 | A>1.5或<0.1 | 稀释或浓缩样品重新测定 |
| 重复性差 | RSD>5% | 增加平行样次数 |
| 空白值偏高 | A₀>0.05 | 检查试剂纯度，更换DNS试剂 |
注意事项与故障排除
1 关键操作警示
- DNS试剂必须现配现用，避光保存不超过2小时
- 沸水浴需保持微沸状态，避免剧烈沸腾导致溶液损失
- 比色应在显色后3060分钟内完成，防止颜色逐渐加深
2 常见问题解决方案
| 故障现象 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 空白管显色 | DNS试剂变质/玻璃仪器未洗净 | 重新配制试剂，酸泡清洗比色皿 |
| 标准曲线非线性 | 梯度稀释误差/移液不准确 | 使用高精度移液器，复核稀释步骤 |
| 样品测定值波动大 | 组织匀浆不均匀/提取液沉淀 | 增加离心步骤，过滤取样 |
【问题与解答】栏目
Q1：DNS显色反应后颜色会随时间变化吗？如何保证测量准确性？
A：显色后前20分钟颜色稳定，之后会因副反应逐渐加深，建议显色后立即冷水浴终止反应，并在30分钟内完成比色，若需批量检测，可将反应液定容后避光保存,按顺序快速测定。
Q2：不同种类的还原糖响应系数是否相同？是否需要制作专属标准曲线？
A：不同还原糖的摩尔消光系数存在差异（如葡萄糖与果糖响应系数相差约8%），当样品中糖组分未知时，建议使用混合标准品或采用葡萄糖当量（Glucose Equivalent, GEA）表示结果，对于单一已知糖类，可使用对应标准曲线提高准确性