5154-dns法测蛋白质

DNS法基于碱性条件下铜离子与蛋白质肽键显色反应，通过紫外分光光度计测定吸光度，快速定量分析

DNS法测定蛋白质水解度的原理与应用

DNS法

1 定义与原理

DNS法（Dinitrosalicylic acid method）全称为3,5二硝基水杨酸法，是一种基于芳香族化合物显色反应的定量分析方法，其核心原理是：在碱性条件下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖的游离醛基共热生成棕红色络合物（最大吸收波长540nm），通过比色法测定还原糖含量，该方法常用于测定蛋白质水解过程中产生的游离氨基（如赖氨酸的α氨基），从而间接反映蛋白质的水解程度。

2 化学反应式

DNS与还原糖反应方程式如下：
$$\text{DNS} + \text{RCHO} \xrightarrow{\Delta} \text{棕红色络合物（λ=540nm）}$$
RCHO代表还原糖的醛基。

dns法测蛋白质

实验试剂与材料

试剂/材料	配制方法与用途
DNS试剂	称取6.5g DNS溶于少量热水，加2mol/L NaOH 325mL，再定容至1000mL，棕色瓶保存。
标准葡萄糖溶液	1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL系列梯度，用于标准曲线绘制。
待测样品	蛋白质水解液（需离心或过滤去除沉淀）。
空白对照	蒸馏水代替样品，消除试剂本底吸光度。

操作步骤

1 标准曲线制作

取7支试管,依次加入不同浓度的标准葡萄糖溶液1mL。
每管加入1.5mL DNS试剂，混匀后沸水浴5分钟。
冷却后定容至25mL,以空白管调零，测定540nm处吸光度。
绘制吸光度（y）浓度（x）标准曲线（线性方程示例：y=0.512x+0.015，R²>0.99）。

2 样品测定

水解液制备：取适量蛋白质样品，加入6mol/L HCl，110℃水解24小时，中和后离心取上清液。
显色反应：取1mL样品液，加1.5mL DNS试剂，沸水浴5分钟，冷却后定容至25mL。
比色测定：540nm处测吸光度，代入标准曲线计算还原糖含量。

结果计算

1 水解度（DH）计算公式

$$\text{DH} = \frac{\text{水解后游离氨基量} \text{水解前游离氨基量}}{\text{总氨基量}} \times 100\%$$
总氨基量通过完全水解（如6mol/L HCl水解24小时）测定。

2 数据示例

样品	吸光度	葡萄糖浓度（mg/mL）	游离氨基量（μg/mL）
水解前	125	2	20
水解后	450	8	80
总氨基	650	2	120
DH	(8020)/120×100%=50%

注意事项

干扰因素：
- 其他还原性物质（如半胱氨酸）会干扰测定，需通过对照实验排除。
- 蛋白质沉淀不完全可能导致吸光度偏高。
关键步骤控制：
- 沸水浴时间：严格控5分钟，过长会导致颜色过深。
- pH调节：水解液中和需彻底，避免残留酸影响显色。

优缺点分析

优点	缺点
灵敏度高（检出限低至0.1μg）	仅适用于还原糖/游离氨基测定
操作简便，适合批量检测	易受其他还原性物质干扰
稳定性好（显色后可稳定2h）	需预热分光光度计

应用场景

食品工业：检测乳制品、肉类蛋白水解程度，评估风味形成。
酶制剂研究：测定蛋白酶活性及水解效率。
生物制药：监控胰岛素、胶原蛋白等药物的降解过程。

问题与解答

问题1：DNS法是否适用于所有蛋白质的水解度测定？

解答：
DNS法主要针对含有游离α氨基的氨基酸（如赖氨酸），因此适用于含大量碱性氨基酸的蛋白质（如酪蛋白、大豆蛋白），但对于富含酸性氨基酸（如谷氨酸）或缺乏游离氨基的蛋白质（如胶原蛋白），需结合其他方法（如茚三酮法）综合分析。