DNS试剂是一种常用的生物化学试剂，主要用于还原糖的定量测定，尤其在酶活性分析中应用广泛，其名称来源于3,5-二硝基水杨酸（3,5-Dinitrosalicylic acid），在碱性条件下与还原糖反应后，生成棕红色的氨基化合物，可通过分光光度计在540 nm波长下测定吸光度，从而计算样品中还原糖的含量，本文将详细介绍DNS试剂的配制方法、颜色变化原理及注意事项。
DNS试剂的配制方法
DNS试剂的配制需要精确控制各组分比例，以确保试剂的稳定性和反应灵敏度,以下是实验室常用的配制步骤及所需试剂：
所需试剂与仪器
- 主要试剂：3,5-二硝基水杨酸（DNS）、氢氧化钠（NaOH）、酒石酸钾钠、重蒸酚、无水亚硫酸钠
- 仪器：电子天平、恒温水浴锅、容量瓶（100 mL、500 mL）、烧杯、玻璃棒
配制步骤
（1）DNS母液配制：
称取6.3 g DNS，溶于少量蒸馏水中，缓慢加入262 mL 2 mol/L NaOH溶液，边加边搅拌，待DNS完全溶解后，加入182 g酒石酸钾钠，继续搅拌至溶解，最后用蒸馏水定容至500 mL，棕色瓶避光保存,备用。
（2）酚溶液配制：
称取100 g重蒸酚，溶于100 mL蒸馏水中,现配现用。
（3）亚硫酸钠溶液配制：
称取5 g无水亚硫酸钠，溶于50 mL蒸馏水中,现配现用。
（4）混合试剂：
将DNS母液、酚溶液和亚硫酸钠溶液按体积比50:5:5混合，室温下静置24小时后使用，混合后试剂呈淡黄色，若颜色过深或出现沉淀,需重新配制。
试剂保存与稳定性
DNS试剂需避光、4℃保存，有效期通常为1个月，使用前需检查试剂是否浑浊或变色,若出现沉淀应过滤后使用。
DNS试剂的颜色变化原理
DNS试剂的颜色变化是其检测还原糖的核心机制,具体反应过程如下：
反应原理
在碱性条件下，DNS被还原糖还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（3-amino-5-nitrosalicylic acid），该化合物呈棕红色，颜色深度与还原糖浓度成正比，反应式如下：
还原糖 + DNS（淡黄色）→ 氨基化合物（棕红色）
显色条件
- pH值：反应需在强碱性环境（pH 10-12）中进行,通常由NaOH提供碱性条件。
- 温度与时间：沸水浴加热5-10分钟可加速反应,显色后需迅速冷却至室温以稳定颜色。
颜色变化的意义
DNS试剂的颜色变化不仅是定性判断的依据，更是定量分析的基础，通过测定540 nm处的吸光度，可绘制标准曲线，计算样品中还原糖的含量,下表为不同还原糖浓度下的颜色变化参考：
| 还原糖浓度（mg/mL） | 显色后颜色 | 吸光度（540 nm） |
|---|---|---|
| 1 | 浅黄色 | 1-0.2 |
| 5 | 橙黄色 | 3-0.5 |
| 0 | 棕红色 | 6-0.8 |
| 0 | 深棕红色 | 9-1.2 |
DNS试剂配制与使用的注意事项
- 试剂纯度：DNS需使用分析纯，避免杂质影响反应灵敏度。
- 操作安全：NaOH和酚具有腐蚀性，需佩戴手套和护目镜。
- 显色控制：加热时间和温度需一致，以减少实验误差。
- 干扰物质：样品中若含有高浓度蛋白质或氨基酸，可能干扰反应,需提前去除。
相关问答FAQs
Q1：DNS试剂配制后出现沉淀，是否还能使用？
A：DNS试剂配制后若出现少量沉淀，可过滤后使用；若沉淀较多或颜色异常（如深褐色），则需重新配制,否则会影响实验结果的准确性。
Q2：如何通过DNS试剂测定酶活性？
A：通过测定酶反应前后还原糖的生成量或消耗量计算酶活性，具体步骤包括：设置反应体系（含底物、酶液），在不同时间点加入DNS试剂终止反应，显色后测定吸光度，根据标准曲线计算酶活性（如μmol/min/mg protein）。