S法测还原糖通过比色法定量，依据540nm处吸光度结合标准曲线计算含量，具体公式可参照标准曲线得出的线性回归
DNS试剂法测定还原糖含量详解
实验原理
3,5 二硝基水杨酸（DNS）在碱性条件下与还原糖共热后，会被还原成棕红色的氨基化合物，在一定波长下（通常为540nm），该物质的吸光度与还原糖浓度成正比，通过制作标准曲线，即可根据样品的吸光度计算出其中还原糖的含量，这种方法具有操作简便、灵敏度高、稳定性好等优点，广泛应用于食品、生物等领域中还原糖的定量分析。
所需仪器与试剂
（一）仪器
| 序号 | 仪器名称 | 规格/型号 | 用途 |
|---|---|---|---|
| 1 | 分光光度计 | 可见光范围，具备540nm波长测定功能 | 测量显色后的溶液吸光度 |
| 2 | 恒温水浴锅 | 可精确控温至特定温度（如沸水浴） | 用于DNS试剂与还原糖的反应 |
| 3 | 容量瓶 | 多种规格（如100mL、250mL等） | 配制标准溶液和样品溶液 |
| 4 | 移液管/移液枪及配套枪头 | 不同量程，精度高 | 准确移取各类液体试剂 |
| 5 | 比色皿 | 适配分光光度计，材质透光性好 | 盛放待测溶液进行吸光度测定 |
| 6 | 试管及试管架 | 若干支，带塞子更好 | 进行反应操作和临时存放样品 |
（二）试剂
| 试剂名称 | 浓度及配制方法 | 备注 |
|---|---|---|
| DNS试剂 | 甲液：称取10g氢氧化钠溶于约600mL水中，加入300g酒石酸钾钠，溶解后再加入5g结晶酚和0.5g无水亚硫酸钠；乙液：称取10g 3,5 二硝基水杨酸溶于适量水中并稀释至1000mL，将甲乙两液混合摇匀，贮于棕色瓶中备用，室温下放置7 10天后使用效果更佳 | 密封保存，防止变质影响结果准确性 |
| 葡萄糖标准储备液（1mg/mL） | 精确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，用少量蒸馏水溶解后定容至100mL容量瓶中 | 作为绘制标准曲线的基础溶液，需低温冷藏保存以防微生物生长导致浓度改变 |
| 待测样品溶液 | 根据实际样品性质适当稀释处理，使其中还原糖含量落在标准曲线线性范围内为宜 | 确保样品清澈无杂质干扰后续测定步骤 |
操作步骤
（一）标准曲线绘制
- 梯度稀释标准品：取6支洁净干燥的试管编号，分别按表1加入不同体积的葡萄糖标准储备液和蒸馏水，使每管最终体积均为一定值（例如均为2mL）。 |试管编号|葡萄糖标准储备液体积（mL）|蒸馏水体积（mL）|对应葡萄糖质量（μg）| ||||| |0|0|2|0（空白对照）| |1|0.2|1.8|200| |2|0.4|1.6|400| |3|0.6|1.4|600| |4|0.8|1.2|800| |5|1.0|1.0|1000|
- 添加DNS试剂并反应：向上述各试管中均加入1.5mL DNS试剂，混匀后置于沸水浴中加热5分钟,取出立即冷水冷却至室温。
- 测定吸光度：以空白管调零，用分光光度计在540nm波长处测定各管溶液的吸光度,记录数据。
- 拟合标准曲线方程：以葡萄糖质量（μg）为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制散点图并通过线性回归拟合得到标准曲线方程y = kx + b（其中y为吸光度，x为葡萄糖质量）。
（二）样品测定
- 预处理样品：若样品含杂质较多或有颜色干扰，需先经过离心、过滤或脱色等前处理步骤，然后根据预估的还原糖大致含量,将其稀释至合适浓度范围。
- 显色反应：取适量稀释后的样品溶液于试管中，加入与绘制标准曲线时相同体积的DNS试剂，同样进行沸水浴加热、冷却操作。
- 计算含量：测定样品管溶液在540nm处的吸光度，代入标准曲线方程计算出样品中相当于葡萄糖的质量，再结合样品的稀释倍数等因素,得出原始样品中还原糖的实际含量。
注意事项
- 精确控制反应时间和温度：加热时间和温度对显色效果影响显著，应严格按照规定条件操作,以保证不同批次间数据的可比性。
- 避免气泡产生：加入DNS试剂后要轻轻混匀，防止产生过多气泡影响比色准确性,若有气泡可用细针小心刺破去除。
- 及时比色：显色后的溶液稳定性有限，应在较短时间内完成吸光度测定,以免因颜色变化导致结果偏差。
- 平行试验：为确保数据的可靠性，每个样品建议做多次平行测定,取平均值作为最终结果。
相关问题与解答
问题1：为什么DNS试剂法测定还原糖时要进行沸水浴加热？
答：沸水浴加热是为了加速DNS试剂与还原糖之间的氧化还原反应速率，使反应充分完全，在高温条件下，还原糖能够迅速将DNS中的硝基还原为氨基，从而生成稳定的棕红色产物，便于后续准确的吸光度测定和定量分析，如果温度过低或加热时间不足，反应不完全会导致显色浅淡甚至不显色，影响测定结果的准确性；而过度加热可能会引起溶液暴沸溅出或者破坏某些不稳定成分,也不利于实验顺利进行。
问题2：如何判断待测样品是否需要稀释以及合适的稀释倍数是多少？
答：可以通过预实验大致了解样品中还原糖的含量水平来确定是否需要稀释，一般而言，如果样品直接测定时的吸光度超出了标准曲线的最高点对应的吸光度值，则说明样品浓度过高，需要稀释，合适的稀释倍数可以通过逐步尝试来确定，即先选择一个较大的稀释倍数进行初步测试，若测得的吸光度仍高于标准曲线上限，则继续增大稀释倍数；反之，若吸光度过低接近空白值，则减小稀释倍数重新测试，理想情况下，稀释后的样品溶液在测定时的吸光度应落在标准曲线的线性范围内且尽量靠近中间部分，这样可以获得较高的测量精度和准确性，还需考虑样品本身的特性和实验目的等因素综合确定最佳的稀释